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    結(jié)直腸癌組織中癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)變化及其意義

    2018-08-31 04:39:04段佳文林楊郭飛屈明薛軍
    山東醫(yī)藥 2018年31期
    關(guān)鍵詞:癌胚抗原淋巴管沖洗

    段佳文,林楊 ,郭飛,屈明,薛軍

    (1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院,河北張家口0750002;2河北北方學(xué)院研究生院)

    結(jié)直腸癌是一種嚴(yán)重危害人群健康的惡性腫瘤。近年,結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年升高,且呈年輕化趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的治療仍以手術(shù)為主,強(qiáng)調(diào)早發(fā)現(xiàn)、早治療。特異性、準(zhǔn)確性較高的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)結(jié)直腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)具有極其重要的價(jià)值[1,2]。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子-1(CEACAM-1)作為癌胚抗原家族重要成員之一,能調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化,同時(shí)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的黏附,還參與血管和淋巴管新生等病理過(guò)程[3,4]。CEACAM-1在乳腺癌、子宮癌、胃癌、胰腺癌等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)[5,6],而在結(jié)直腸癌中的表達(dá)相關(guān)報(bào)道較少。本研究觀察了50例份結(jié)直腸癌組織CEACAM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)變化,探討其臨床意義。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 選擇2013年1月~2014年1月間我院收治的50例原發(fā)性直腸癌患者,其中其中男27例、女23例,年齡35~71(52.3±9.0)歲;TNM分期為Ⅰ期2例、Ⅱ期9例、Ⅲ期27例、Ⅳ期12例。入選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理檢查確診,均為原發(fā)性肝癌,未進(jìn)行術(shù)前新輔助放化療,且病例資料完整無(wú)誤。排除標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前行新輔助放化療治療,復(fù)發(fā)性肝癌,有心腦血管疾病及其他手術(shù)禁忌證等。50例患者均行腫瘤切除術(shù),術(shù)中保留癌組織(觀察組)及癌旁組織(對(duì)照組,至癌灶邊緣至少10 cm處且經(jīng)病理診斷確診為正常組織)標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),納入者均簽署知情同意書(shū)。

    1.2 儀器與試劑 兔抗人濃縮型CEACAM-1單克隆抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉公司,RM-2245組織切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)LEICA公司,Odyssey雙色紅外熒光成像儀購(gòu)于德國(guó)LI-COR公司,TRIzol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,DEPC水購(gòu)于美國(guó)Sima公司,RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑購(gòu)于上海基星生物科技有限公司。

    1.3 CEACAM-1 mRNA檢測(cè)方法 采用RT-PCR法。提取總RNA濃度,設(shè)計(jì)CEACAM-1上游引物:5′-CAGTCACCTTGAATGTCACCTATG-3′,下游引物:5′-GTTCCATTGATAAGCCAGGAGTAC-3′;GAPDH上游引物:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游引物:5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′;反應(yīng)體系:1×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 0.5 μL,cDNA模板2 μL,Taq酶1.25 U,上下游引物各1 μL,RNA 酶抑制劑1 μL,反應(yīng)總體積25 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,40個(gè)循環(huán),2%瓊脂糖凝膠后電泳。以2-△△Ct代表CEACAM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.4 CEACAM-1蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)CEACAM-1蛋白。取兩組標(biāo)本,石蠟包埋后4 μm切片,脫蠟水化,沖洗后滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復(fù),冰水中冷卻,PBS沖洗,3%的H2O2室溫封閉,PBS沖洗,滴加CEACAM-1一抗(1∶200)。每張切片50 μL,4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗,滴加特異性二抗,室溫下DAB顯色,PBS沖洗,蘇木精輕度復(fù)染,鹽酸乙醇分化,流水沖洗,梯度乙醇脫水,松節(jié)油透明,樹(shù)膠封片,陰性對(duì)照為PBS代替一抗,光鏡下觀察。CEACAM-1陽(yáng)性染色主要集中于細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯棕色或棕黃色顆粒且染色程度大于25%的細(xì)胞為CEACAM-1陽(yáng)性細(xì)胞,計(jì)算兩組陽(yáng)性表達(dá)率。陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.5 隨訪方法 術(shù)后隨防至2017年12月31日,隨訪方法為定期復(fù)查、電話隨訪。

    2 結(jié)果

    觀察組、對(duì)照組CEACAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.99±0.08、0.20±0.05,二者比較,P<0.05;觀察組、對(duì)照組CEACAM-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.00%(34/50)、28.00%(14/50),二者比較,P<0.05。CEACAM-1表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見(jiàn)表1。CEACAM-1表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移等有關(guān)(P均<0.05)。

    中位隨訪時(shí)間56個(gè)月,50例患者中23例生存,27例死亡。 死亡、生存患者CEACAM-1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為88.89%(24/27)、43.48%(10/23),二者比較,P<0.05。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示,CEACAM-1表達(dá)陽(yáng)性和陰性患者的生存函數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.394,P=0.031),即CEACAM-1表達(dá)和患者生存時(shí)間相關(guān),CEACAM-1陽(yáng)性患者預(yù)后較差。

    表1 結(jié)直腸癌組織中CEACAM-1蛋白的表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

    Cox回歸模型分析顯示,CEACAM-1表達(dá)、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(95%CI分別為1.365~1.917,1.725~2.363,1.041~1.620,1.160~1.741;P均<0.05)。

    3 討論

    CEACAM-1是一種跨膜糖蛋白,屬于癌胚抗原家族及免疫超蛋白家族黏附分子之一,最初是由Ocklind等[7]在研究木瓜蛋白酶質(zhì)膜的不溶性成分的某些作用和功能時(shí)被發(fā)現(xiàn),在人體內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞中都有較為廣泛的分布。CEACAM-1基因定位于人類(lèi)染色體的19q13.2區(qū)域,該基因的組成是由9個(gè)外顯子按特定序列排列而成,第1個(gè)含ATG啟動(dòng)子,第2個(gè)負(fù)責(zé)編碼IgV樣結(jié)構(gòu)域,第3至5個(gè)外顯子則用于編碼IgC2樣結(jié)構(gòu)域,第6個(gè)編碼TM跨膜區(qū),第7個(gè)包含53個(gè)bp,可通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生CEACAM-1-L、CEACAM-1-S長(zhǎng)短兩種不同的亞型,較長(zhǎng)的CEACAM-1-L包含第 7、8個(gè)外顯子,由72~74個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,而較短的CEACAM-1-S則由12~14個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,僅含第9個(gè)外顯子TGA-S[8]。CEACAM-1-L胞內(nèi)段含有2個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序通過(guò)其磷酸化參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮抑制下游信號(hào)的作用,而CEACAM-l-S則無(wú)此基序,但含有結(jié)合鈣調(diào)蛋白、原肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)域,對(duì)細(xì)胞骨架有調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞表面CEACAM-1-L主要以一種順式同源二聚體的形式存在,不同活化狀態(tài)下的細(xì)胞二聚體不同,可能參與不同的信號(hào)調(diào)節(jié)通路,CEACAM-1-L還可以在細(xì)胞間形成反式二聚體,介導(dǎo)細(xì)胞間黏附[9]。

    CEACAM-l還可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞分化,對(duì)胰島素代謝和免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程具有重要作用。研究[10]證實(shí),CEACAM-1參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)過(guò)程,其異常表達(dá)可能是引起和維持結(jié)直腸癌惡性表型的原因之一。此外,CEACAM-1還與脈管結(jié)構(gòu)形成有不可分割的關(guān)系,這其中就包括對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用的血管、淋巴管生成過(guò)程[11,12]。CEACAM-1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的關(guān)系極為密切,是VEGF的一個(gè)重要效應(yīng)分子。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),CEACAM-1的高表達(dá)會(huì)引起VEGF、VEGFR-2、angiopoietin-1等血管生長(zhǎng)因子表達(dá)上調(diào),促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂,進(jìn)而形成微血管,而當(dāng)使用抗體抑制CEACAM-1后,相應(yīng)的VEGF介導(dǎo)的微血管轉(zhuǎn)化也收到抑制[13]。Yurdakul等[14]研究顯示,CEACAM-1在腫瘤組織的淋巴管內(nèi)皮中常有表達(dá),可能是腫瘤新生淋巴管的標(biāo)志物。Horst等[15]的小鼠模型實(shí)驗(yàn)論證了在調(diào)節(jié)微淋巴管重建的過(guò)程中,內(nèi)皮細(xì)胞上的CEACAM-1表達(dá)起到了重要作用,相反基質(zhì)膠阻塞試驗(yàn)及后肢缺血模型的新生毛淋巴管重建的失敗正是由CEACAM1的缺少造成。

    本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),觀察組CEACAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)均高于癌旁組織,表明CEACAM-1高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌變的發(fā)生和發(fā)展,且CEACAM-1表達(dá)越高,其對(duì)周?chē)M織器官的侵襲能力越強(qiáng),肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越大,TNM分期越晚。吳濤等[16]研究證實(shí)結(jié)直腸癌組織中CEACAM-1參與腫瘤微血管的生成及血管浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。申寶鳴等[17]報(bào)道大腸癌患者的血清中CEACAM-1水平明顯超過(guò)正常組,CEACAM-1很可能是大腸癌早期診斷的一項(xiàng)重要指標(biāo)。進(jìn)一步研究顯示CEACAM-1與結(jié)直腸癌患者的生存期相關(guān),CEACAM-1表達(dá)越高,其生存期越短,預(yù)后越差,CEACAM-1表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素。

    綜上所述, 結(jié)直腸癌組織中存在CEACAM-1高表達(dá)。CEACAM-1的表達(dá)異常在結(jié)直腸癌病變的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,CEACAM-1可能與結(jié)直腸癌的預(yù)后有關(guān)。

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