BMP7蛋白對大鼠急性脊髓損傷后神經元修復作用的研究*

張玉玲 白廣超 金宏亮 張文 李寬新*

脊髓損傷是一種高致殘率的中樞神經系統疾病，其常由車禍傷、高處墜落傷等引起[1]。原發(fā)性機械損傷及繼發(fā)性神經功能障礙可導致局部神經元死亡、炎性因子浸潤、軸突脫髓鞘等一系列變化，使得脊髓損傷的治療成為脊柱外科領域的難點[2]。由于神經元的不可再生性，脊髓損傷后神經元的修復及補充就成了脊髓損傷治療的關鍵[3]。目前研究表明，屬于轉化生長因子-（TGF-）超家族的骨形態(tài)發(fā)生蛋白 7（bone morphogenetic protein 7, BMP7）具有神經保護功能[4]，本研究使用BMP7蛋白治療大鼠脊髓損傷模型，檢測神經修復標志蛋白表達情況，探索BMP7蛋白脊髓損傷后神經細胞的修復作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級 Wistar大鼠70只，雄性，4周齡，體質量約110 g，由石河子大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。所有實驗操作均符合實驗動物倫理學要求。

1.2 主要試劑

BMP7蛋白（美國R＆D公司）、10%水合氯醛（上海聯碩生物科技有限公司）、0.9%氯化鈉注射液（新疆華世丹藥業(yè)有限公司）、蘇木素染液、伊紅染液及中性樹膠（上海榕柏生物技術有限公司）、大鼠神經絲蛋白200（neurofilament protein 200,NF200）單克隆抗體、大鼠膠質纖微酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體及大鼠突觸素（Synaptophysin，SYP）單克隆抗體（abnova公司，美國）、羊抗大鼠 IgG-HRP（上海君瑞生物技術有限公司）、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 主要儀器

Allences's打擊器（石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨科中心提供）、0.1mm 聚乙烯導管（自制）、動物手術器械（深圳瑞沃德公司）、石蠟包埋機 SPCC-6D及切片機SPCC-335（東莞市譜標實驗器材科技有限公司）、烘箱OGS60（美國ThermoFisher）、光學顯微鏡E100（日本Nikon）、生物安全柜（蘇州安泰公司）、純水器（成都超純公司）。

1.4 大鼠急性脊髓損傷模型的建立

以簡單隨機抽樣法把Wistar大鼠分為陰性對照組（NC組）及BMP7實驗組（BMP7組），每組30只，10只備用。術前常規(guī)備皮、消毒，以每100 g體質量腹腔內注射30 mg 10%水合氯醛進行麻醉，背正中切口暴露出第10胸椎椎板，剪除椎板暴露硬脊膜，以Allences's打擊器按照15g×20cm的能量大小打擊大鼠第10胸椎段脊髓，把0.1mm聚乙烯導管一端植入損傷處蛛網膜下，另一端肝素帽封閉，逐層縫合硬脊膜、肌肉及皮膚。

大鼠急性脊髓損傷模型建立成功標準：局部可見損傷處脊髓組織出血、水腫，但硬脊膜保持完整，行為學可見大鼠出現痙攣性擺動，軀體回縮撲動，雙后肢遲緩性癱瘓[5]。

術后處理：所有大鼠分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水，每天更換墊料，術后3d每天給予1次青霉素肌注（4萬U/次），每天給予2次膀胱按壓輔助排尿直至自主排尿功能恢復。BMP7組每天通過0.1 mm聚乙烯導管向脊髓損傷部位給予50ngBMP7蛋白（體積為100 L），NC組每天給予100 L的0.9%氯化鈉注射液，術后30min第1次給藥，隨后每天給藥1次，連續(xù)7天。

1.5 HE染色觀察各組大鼠脊髓損傷節(jié)段組織形態(tài)學變化

NC組及BMP7組術后6 h、3 d、1、2、4及8周分別取5只大鼠，以每100 g體重腹腔內注射30 mg 10%水合氯醛進行麻醉，打開胸腔暴露心臟，左心室內灌注冰的0.9%氯化鈉注射液（含肝素鈉，15 U/mL）直至大鼠身體僵硬，隨后以4%多聚甲醛灌注固定。背部原切口進入取出以損傷處為中心長約1 cm脊髓組織，置于4%多聚甲醛內固定24 h，石蠟包埋后以切片機制作厚度為6 m的組織切片，每只大鼠制作6張切片，3張用于HE染色，3張用于免疫組化實驗。切片置于60℃烘箱內30 min以使蠟融化，隨后置于二甲苯中脫蠟，乙醇梯度脫水，蘇木素染液染5min，1%鹽酸乙醇分化10 s，伊紅染色3 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察。

1.6 免疫組化檢測各組大鼠脊髓損傷節(jié)段NF200、GFAP及SYP的表達量

每只大鼠取上述制備的3張切片，切片置于60℃烘箱內30 min以使蠟融化，隨后置于二甲苯中脫蠟，乙醇梯度脫水，含0.3%H2O2的甲醛室溫浸泡10min以消除內源性過氧化物酶活性，切片置于0.01 mol/L枸櫞酸溶液中煮沸10 min以修復抗原，切片冷卻后置于山羊血清封閉液中20min，孵一抗（NF200、GFAP及SYP大鼠單克隆抗體稀釋倍數均為1∶200），4℃過夜。切片置于37℃烘箱中復溫45 min，PBS沖洗后室溫孵二抗2 h（羊抗鼠 IgG，每張切片滴50 L），隨后按照DAB顯色試劑盒說明書進行顯色，蘇木素復染2min，1%鹽酸乙醇分化10s，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，隨后進行封片，置于光學顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取10個視野進行陽性細胞計數，取其平均值。

1.7 統計學方法

應用SPSS19.0統計軟件對數據進行統計學分析，符合正態(tài)分布的計量數據用表示，組間比較采用獨立樣本 檢 驗，p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠脊髓損傷處HE染色結果

術后第3d可見兩組大鼠脊髓損傷處神經元數量減少，神經元細胞核固縮，神經突觸數量減少，尼式體淡染且數量減少，組織中出現許多空泡。1、2、4及8周時，BMP7組大鼠脊髓損傷處尼式體染色加深，空泡數量逐漸減少，神經突觸數量增多，變化較NC組明顯（見圖1，彩圖見插頁）。

圖1，不同時間點兩組大鼠脊髓損傷處HE染色結果（×400）。

2.2 免疫組化檢測各組大鼠不同時間點脊髓損傷處NF200、GFAP及SYP蛋白表達結果

NC組及BMP7組大鼠脊髓損傷節(jié)段均可見NF200、GFAP及SYP陽性表達的細胞，見圖2（彩圖見插頁）。BMP7組大鼠NF200陽性表達細胞數術后3 d逐漸增多，至第4周時達到高峰，且在1、2、4及8周時均大于NC組，差異具有統計學意義；BMP7組及NC組術后GFAP陽性表達細胞數變化均不明顯，且兩組陽性細胞數差異不顯著；BMP7組大鼠SYP陽性表達細胞數術后3 d逐漸增多，且在1、2、4及8周時均大于NC組，差異具有統計學意義（見表1-3，圖3）。

圖2，免疫組化檢測不同時間點各組大鼠脊髓損傷節(jié)段NF200、GFAP及SYP蛋白表達結果（×400）a：BMP7組b：NC組。

圖3，免疫組化檢測結果中各組大鼠脊髓損傷節(jié)段NF200、GFAP及SYP蛋白陽性表達細胞數量。

表1，不同時間點各組大鼠脊髓損傷處NF200陽性表達細胞數量

表2，不同時間點各組大鼠脊髓損傷處GFAP陽性表達細胞數量

表3，不同時間點各組大鼠脊髓損傷處SYP陽性表達細胞數量

3 討論

脊髓損傷病理過程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個階段。原發(fā)性損傷是指患者在車禍、高處墜落時由于機械原因導致脊柱骨折塊的移位、椎間盤髓核脫入椎管等引起脊髓的壓迫、沖擊、撕裂等直接損傷；繼發(fā)性損傷是由于原發(fā)性損傷引起了受損脊髓局部缺血、水腫、生長因子缺乏，從而導致脊髓受損處及相鄰節(jié)段神經細胞死亡[6]。繼發(fā)性損傷對脊髓功能造成的損害遠高于原發(fā)性損害，因為局部環(huán)境的改變不利于神經細胞及軸突的修復，因此，早期使用營養(yǎng)因子抑制繼發(fā)性損害、改善局部微環(huán)境及促進神經細胞修復是脊髓損傷治療的關鍵[7]。

BMP是由Urist等在1965年的研究中發(fā)現的一類營養(yǎng)因子，是一種低分子糖蛋白，最早發(fā)現其具有成骨作用，因此命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein)[8]。越來越多的研究表明，BMP家族不僅與成骨有關系，也跟神經發(fā)育聯系緊密，尤其是BMP7。De RiveroVaccariJP等[9]在研究中發(fā)現 BMP7可以增強中樞神經損傷后的功能恢復，利于樹突的生長。因此，我們立項研究 BMP7蛋白在脊髓損傷后是否利于改善局部微環(huán)境，促進神經細胞的修復。我們以Allen's打擊法建立大鼠脊髓損傷模型，隨后對脊髓損傷處注射BMP7蛋白，HE染色觀察脊髓損傷處病理學變化，結果表明 BMP7實驗組大鼠脊髓損傷處神經元及神經突觸數量較對照組高，提示 BMP7蛋白利于脊髓損傷后神經功能的修復。

為了進一步研究 BMP7蛋白促進脊髓損傷后神經功能恢復的具體機制，我們以免疫組化法檢測不同時間點脊髓損傷處神經細胞的標志蛋白表達量。NF是神經元的標志蛋白之一，其主要存在于神經元的胞體及軸突中，在維護神經元的功能和軸漿轉運中發(fā)揮著重要的作用。根據分子量的大小，NF可分為 NF68、NF140及 NF200，NF200正常情況下主要存在與神經元軸突中，胞體中幾乎沒有，但在脊髓損傷后神經元會大量合成NF200以修復神經元胞體及軸突，故NF200的表達量可反映神經元的數量及活性[10]。GFAP是星形膠質細胞的骨架蛋白，其表達量可以反應星形膠質細胞的功能狀態(tài)，GFAP表達量升高可以促進脊髓損傷處膠質瘢痕的形成，不利于神經軸突的修復及神經通路的恢復[11]。SYP是一種鈣離子結合蛋白，主要存在于神經元軸突及樹突的突觸泡膜上，其表達量可反應軸突的修復及突觸的再生情況[12]。

本研究使用BMP7蛋白局部注射治療大鼠脊髓損傷，并與對照組進行比較。結果表明：①BMP7組NF200表達量3d后明顯升高，且高于對照組，提示BMP7蛋白可以提高脊髓損傷后神經元數量及活性，BMP7蛋白提高脊髓損傷處神經元的活性表明其具有神經營養(yǎng)功能；②BMP7組GFAP表達量與對照組相比差異不顯著，表明 BMP7蛋白對脊髓損傷后星形膠質細胞數量及活性的影響不明顯，這有利于減少局部膠質瘢痕形成及神經通路的修復；③BMP7組SYP表達量3d后明顯升高，且高于對照組，提示BMP7蛋白具有促進脊髓損傷后神經元軸突修復的作用，有利于脊髓損傷后期運動及感覺神經傳導的恢復。以上表明 B MP7蛋白可以促進脊髓損傷后神經功能的恢復，其機制是促進神經元及軸突修復而實現。

對NF200、GFAP、SYP三個標記物不同時間的縱向比較可以看出NF200和SYP的表達量3 d后逐漸升高，至第4周左右達到高峰，第8周時仍維持在較高水平。我們推測其原因可能有以下兩點：①目前國內外的研究表明，BMP7具有促進干細胞跨胚層向神經元分化[13-15]，我們在早期研究中也證實了這一點[16]。局部注射的 B MP7促進了髓腔膜干細胞/祖細胞向神經元細胞分化，使局部脊髓損傷處神經元數量持續(xù)增加，神經突觸的數量也隨之增加，神經元標志物NF200及突觸標志物SYP表達量持續(xù)增高。② BMP7具有改善中樞神經系統損傷局部微環(huán)境的作用[17]，Guan J在腦缺血大鼠模型的腦室內注射 B MP7蛋白，結果發(fā)現腦缺血處局部血液循環(huán)增加[18]，但其具體機制尚未揭示，故我們推測同為中樞神經的脊髓，其損傷后注射 BMP7蛋白可以改善局部微環(huán)境，利于存活的神經元的生長，微環(huán)境的改善使得神經元細胞持續(xù)修復。以上兩點只是我們的推測，其具體機制仍需我們在今后的試驗中探索、驗證。

本研究初步探索了 B MP7蛋白在脊髓損傷后促進神經細胞修復的作用，并進一步揭示其具體機制，為 B MP7蛋白用于脊髓損傷的臨床治療提供了基礎依據。