CD20單核苷酸多態(tài)性對(duì)利妥昔單抗治療急性淋巴細(xì)胞白血病的影響

劉卉 劉宇宏

1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科（西安 710071）；2延安大學(xué)附屬醫(yī)院免疫血液科（陜西延安 716000）

利妥昔單抗是一種由小鼠抗體可變區(qū)序列和人源化抗體恒定區(qū)及Fc區(qū)序列組成的人鼠嵌合性抗CD20單克隆抗體［1］。利妥昔單抗通過與細(xì)胞表面上的CD20結(jié)合誘發(fā)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用和抗體依賴性細(xì)胞毒作用以及細(xì)胞凋亡作用來殺傷癌細(xì)胞［1-2］。利妥昔單抗已經(jīng)作為治療急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）的重要手段之一。筆者通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，ALL患者在臨床治療中對(duì)利妥昔單抗表現(xiàn)出一定的拮抗性，但是這種拮抗的分子機(jī)制尚未明確。大多數(shù)ALL患者白血病細(xì)胞僅表達(dá)淋巴細(xì)胞抗原，其中30%～40%前B細(xì)胞和80%～90%成熟B細(xì)胞表達(dá)CD20抗原［3］。CD20在ALL細(xì)胞的高表達(dá)為抗CD20單克隆抗體利妥昔靶向治療ALL提供了理論基礎(chǔ)［4］。但是關(guān)于CD20單核苷酸多態(tài)性與抗CD20的利妥昔單抗治療ALL之間的關(guān)系尚不明確，因此本研究報(bào)道了CD20編碼的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs2070770與急性淋巴細(xì)胞白血病對(duì)利妥昔單抗的響應(yīng)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月至2017年2月確診為ALL的患者308例?；颊吣挲g0～30歲；男162例，女146例?；颊唠S機(jī)分為兩組，對(duì)照組（n=154）：患者接受5個(gè)療程常規(guī)化療；試驗(yàn)組（n=154）患者在接受常規(guī)化療的同時(shí)聯(lián)合利妥昔單抗治療，每周劑量為375 mg/m2，連續(xù)使用4周。排除父母與子代均參與本研究。本研究通過醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)?；颊吆炇鹬橥鈺?/p>

風(fēng)險(xiǎn)組劃分：低危組包括超二倍體（51～65條染色體）、t（12；21）（p13；q22）和（或）ETV6?RUNX1；高危組包括亞二倍體（＜44條染色體）、t（v；11q23）、t（9；22）（q34；q11.2）和復(fù)雜染色體異常。在人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和不同的疾病特征間基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 CD20 SNP基因分型CD20編碼的SNP rs2070770?Ala14Val基因分型通過 TaqMan SNP 基因分型技術(shù)檢測(cè)，并隨機(jī)選取每種基因型的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，驗(yàn)證結(jié)果?；蛐皖l率符合Hardy?Weinberg平衡。

1.3 細(xì)胞表面CD20的表達(dá)水平使用流式細(xì)胞儀測(cè)量骨髓細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度檢測(cè)CD20表達(dá)量。骨髓細(xì)胞與CD20?FITC在黑暗中孵育20 min，然后加入pH 7.2 NH4Cl裂解5 min，PBS清洗，1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，記錄數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料結(jié)果以s的形式表示，使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性，兩組資料的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；兩樣本率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs2070770基因型頻率308例患者rs2070770基因分型：CC基因型157例（51.0%），CT基因型116例（37.7%），TT基因型35例（11.4%），等位基因T頻率為30.2%。對(duì)照組與試驗(yàn)組間基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低危組與高危組間基因型頻率比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 受試者CD20 rs2070770基因型頻率Tab.1 CD20 rs77878271 genotype frequencies of subjects

2.2 rs2070770基因型與白血病細(xì)胞表面CD20強(qiáng)度有關(guān)對(duì)照組、試驗(yàn)組、低危組和高危組的純合子CC基因型患者的癌細(xì)胞CD20表達(dá)高于雜合子CT和純合子TT，雜合子CT患者的癌細(xì)胞CD20表達(dá)高于純合子TT患者。rs2070770等位基因T與細(xì)胞表面低CD20表達(dá)顯著相關(guān)（表2）。

表2 rs2070770基因型與淋巴細(xì)胞表面CD20表達(dá)Tab.2 rs2070770 genotype and cell surface CD20 expression in leukemic cells ± s

表2 rs2070770基因型與淋巴細(xì)胞表面CD20表達(dá)Tab.2 rs2070770 genotype and cell surface CD20 expression in leukemic cells ± s

組別對(duì)照組試驗(yàn)組低危組高危組例數(shù)154 154 206 102 CC（n=157）CT（n=116）TT（n=35）n 76 81 137 20 CD20 262.1±12.3 178.7±9.1 121.6±9.0 228.2±15.7 n 59 57 101 15 CD20 126.7±10.2 158.7±10.8 88.3±6.3 183.1±8.6 n 18 17 30 5 CD20 34.5±4.6 55.8±4.9 38.9±3.8 50.5±4.5 χ2值7.82 7.29 8.56 6.43 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 rs2070770基因型決定了急性淋巴細(xì)胞白血病臨床應(yīng)答rs2070770 SNP基因型與臨床終點(diǎn)OS（總生存期）、DFS（無病生存期）、RR（相對(duì)危險(xiǎn)度）和TRM（病死率）有關(guān)。對(duì)照組rs2070770純合子CC基因型患者的RR為48.3%，試驗(yàn)組rs2070770純合子CC基因型患者的RR為25.6%（P＜0.01）。兩組患者的DFS分別為45.5%和63.7%（P＜0.01）（表3）。相反的，利妥昔單抗治療后雜合子CT和純合子TT基因型患者RR與無利妥昔單抗治療組的RR無差異。不同基因型的患者5年OS和TRM差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CT和TT基因型患者的療效相似。

表3 rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點(diǎn)Tab.3 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome ± s

表3 rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點(diǎn)Tab.3 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome ± s

臨床結(jié)局例數(shù)5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=157）CT（n=116）TT（n=35）對(duì)照組76 57.9±7.2 45.5±9.4 48.3±9.2 4.3±1試驗(yàn)組81 64.2±7.1 63.7±7.3 25.6±7.2 8.2±5.5 P（χ2）值P（χ2）值P（χ2）值0.16（1.11）＜0.01（6.74）＜0.01（7.32）0.14（1.16）對(duì)照組59 67.2±7.6 62.2±9.5 38.2±9.3 3.3±3.5試驗(yàn)組57 63.2±8.1 55.2±9.5 36.8±9.1 5.5±4.2 0.66（0.19）0.82（0.07）0.96（0.05）0.50（0.31）對(duì)照組19 68.9±10.2 54.7±10.6 45.6±10.8-試驗(yàn)組16 66.9±12.4 51.5±12.5 43.6±10.8 1±2.2 0.82（0.07）0.98（0.05）0.86（0.06）0.29（0.82）

2.4 不同危險(xiǎn)組rs2070770基因型患者利妥昔單抗治療的臨床療效在低危組，利妥昔單抗治療后CC基因型患者RR為10.5%，無利妥昔單抗治療組CC基因型患者RR為36.7%（P＜0.01）。相反的，利妥昔單抗治療后雜合子CT和純合子TT基因型患者RR與無利妥昔單抗治療組的RR無差異（表4）。在高危組，利妥昔單抗治療后CC基因型患者RR為35.6%，無利妥昔單抗治療組CC基因型患者RR為71.0%（P=0.07）（表5）。不同險(xiǎn)組內(nèi)，不同基因型的患者5年OS和TRM沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過比較可知，利妥昔單抗對(duì)rs2070770 CC基因型患者響應(yīng)較好，而且在低危組的療效高于高危組。

表4 低危組rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點(diǎn)Tab.4 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in low risk group ± s

表4 低危組rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點(diǎn)Tab.4 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in low risk group ± s

臨床結(jié)局例數(shù)5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=137）CT（n=101）TT（n=30）對(duì)照組65 72.1±11.5 55.7±13.2 36.7±13.1 6.2±6.0試驗(yàn)組72 90.3±7.5 84.4±9.2 10.5±8.2 6.2±6.5 P（χ2）值P（χ2）值P（χ2）值0.02（3.28）＜0.01（7.56）＜0.01（6.88）0.94（0.06）對(duì)照組57 87.8±8.2 72.2±13.5 25.6±13.1 2.0±4.0試驗(yàn)組44 74.4±12.2 70.5±14.1 19.3±11.2 11.5±10.5 0.06（2.78）0.79（0.09）0.48（0.52）0.11（1.56）對(duì)照組15 85.3±17.2 61.5±18.2 39.5±18.3 0試驗(yàn)組15 80.3±22.8 54.5±30.5 42.5±30.2 0 0.76（0.09）0.68（0.18）0.68（0.17）1.00（＜0.01）

表5 高危組rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點(diǎn)Tab.5 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in high risk group ± s

表5 高危組rs2070770 SNP基因型與患者的臨床終點(diǎn)Tab.5 Genetype of rs2070770 SNPand clinical outcome in high risk group ± s

臨床結(jié)局例數(shù)5年OS（%）DFS（%）RR（%）TRM（%）CC（n=20）CT（n=15）TT（n=5）對(duì)照組9 45.6±12.3 30.8±12.9 71.0±23.2 0±0試驗(yàn)組11 41.3±19.5 43.5±20.6 35.6±27.1 21.5±23.5 P（χ2）值P（χ2）值 試驗(yàn)組P（χ2）值0.77（0.09）0.50（0.31）0.07（2.12）0.13（1.18）對(duì)照組7 32.5±12.5 28.5±12.6 65.7±13.7 7.5±14.2試驗(yàn)組8 60.2±12.1 56.8±12.5 44.5±12.6 0±0 0.06（2.15）0.11（1.21）0.26（0.85）0.27（0.98）對(duì)照組2 15.2±10.4-25.8±20.2 0±0 3--30.8±21.4 25.5±20.5 0.64（0.19）0.62（0.22）0.92（0.07）0.33（0.72）

3 討論

美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）最新發(fā)布的臨床實(shí)踐指南指出可以考慮使用靶向作用于特定異常的新型免疫制劑，針對(duì)CD20表達(dá)B細(xì)胞譜系A(chǔ)LL的抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗。最近有研究顯示，利妥昔單抗單藥治療CD20+急性淋巴細(xì)胞白血病具有一定的療效，在標(biāo)準(zhǔn)化療中加入利妥昔單抗效果更加顯著，可有效提高低中度風(fēng)險(xiǎn)患者的生存率［5-6］。對(duì)于青少年急性淋巴細(xì)胞白血病，本研究結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)化療聯(lián)合利妥昔單抗可以有效改善患者的臨床結(jié)局，患者癌細(xì)胞CD20出現(xiàn)變異會(huì)降低利妥昔單抗對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病的治療療效。ALL的處理方案很大程度上與患者的年齡有關(guān)，15～39歲的患者可考慮采用治療兒童的強(qiáng)化療法，年齡≥40歲的成年人很難耐受大劑量的兒童強(qiáng)化療法，因此本研究的患者納入年齡范圍為0～30歲。

有研究報(bào)道CD20 rs2070770基因多態(tài)性的編碼、調(diào)控及細(xì)胞表面CD20表達(dá)與臨床結(jié)局有關(guān)［7-9］。本研究結(jié)果與前人研究保持一致，SNP rs2070770可以預(yù)測(cè)利妥昔單抗對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病的應(yīng)答，而且rs2070770基因型與白血病細(xì)胞表面CD20表達(dá)顯著相關(guān)。有研究報(bào)道利妥昔單抗的療效受限于CD20的高表達(dá)［10-11］和細(xì)胞較好的遺傳性［12-13］。因此本研究評(píng)價(jià)了不同危險(xiǎn)組CD20基因型對(duì)利妥昔單抗療效的影響。利妥昔單抗聯(lián)合化療與單獨(dú)化療組相比，低危組和高危組CC基因型患者的RR幾乎下降了50%左右，DFS也出現(xiàn)一定程度的升高；當(dāng)患者出現(xiàn)T等位基因的時(shí)候，兩組患者的RR和DFS幾乎沒有變化。低危組與高危組對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，利妥昔單抗對(duì)rs2070770 CC基因型患者響應(yīng)較好，而且在低危組的療效高于高危組。

綜上所述，rs2070770位點(diǎn)CC基因型患者在接受利妥昔單抗治療時(shí)效果較好，它是預(yù)測(cè)患者是否適于利妥昔單抗治療的一種潛在生物標(biāo)志物。而且對(duì)于不同危險(xiǎn)程度的患者來說，低危險(xiǎn)患者對(duì)利妥昔單抗的響應(yīng)更好。