β淀粉樣蛋白1?42對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲的影響

廖丹丹 蔡丹純 高云飛 盛超

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州 510515）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種以高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)、嚴(yán)重危害母兒健康的妊娠期特發(fā)性疾病。在我國(guó)發(fā)病率為2%～8%，是圍生期母嬰死亡的主要原因之一［1］。目前主流觀點(diǎn)普遍認(rèn)為子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙導(dǎo)致胎盤形成缺陷是PE發(fā)病的始動(dòng)因素［2-3］，而螺旋動(dòng)脈血管重鑄障礙的實(shí)質(zhì)是滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力下降［4］。最近蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，包括β淀粉樣蛋白（Aβ 1?42）在內(nèi)的多種錯(cuò)誤折疊蛋白異常聚集于PE患者的胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)，提示PE可能是一類蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病［5］。然而，目前國(guó)內(nèi)外未見β淀粉樣蛋白1?42對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲功能影響的報(bào)道。本研究擬利用體外細(xì)胞模型，深入探討Aβ1?42對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲的影響及調(diào)控機(jī)制，為β淀粉樣蛋白在PE的病理發(fā)生中所起的作用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料本研究所用的細(xì)胞系為永生化的人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR?8/SVneo細(xì)胞，由加拿大皇后大學(xué)Charles H.Graham教授惠贈(zèng)。主要試劑：Aβ 1?42購(gòu)自Sigma公司；培養(yǎng)基RPMI 1640和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；CCK?8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；總蛋白提取試劑盒購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；vimentin，N?cad?herin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；β?actin抗體購(gòu)自武漢博士德公司；辣根過氧化物酶IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司；抗 Aβ1?42抗體、MMP?2及MMP?9 ELISA試劑盒購(gòu)自Abcam；MMP?2/MMP?9活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自AnaSpec。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Aβ1?42的配制將Aβ1?42凍干粉溶于DMEM培養(yǎng)基，配制成200μmol/L儲(chǔ)備液，置于37℃培養(yǎng)箱孵育7 d，使之老化，過濾分裝，-20℃保存。臨用時(shí)以DMEM培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組HTR?8/SVneo細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，適時(shí)換液及傳代。細(xì)胞處理具體分組為：（1）對(duì)照組：在正常條件下培養(yǎng)HTR?8/SVneo 細(xì)胞；（2）Aβ1?42組：加入10 μmol/L Aβ1?42處理HTR?8/SVneo細(xì)胞24 h；（3）Aβ1?42＋抗Aβ1?42抗體組：同時(shí)加入10 μmol/L Aβ1?42及1：750稀釋抗Aβ1?42抗體處理HTR?8/SVneo細(xì)胞24 h。

1.2.3 CCK?8法測(cè)定細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR?8/SVneo細(xì)胞，接種于96孔板，每孔1× 104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，之后給予不同濃度 Aβ1?42（0、5、10、15、20 μmol/L），同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)立空白組。處理24 h后，每孔加入CCK?8試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值。細(xì)胞增殖活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值?空白組OD值）/（對(duì)照組細(xì)胞OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.4 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力選取24孔板的Transwell小室，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。上述各組細(xì)胞經(jīng)終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，用無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，各組分別取200μL加入到上室內(nèi)，取600μL含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基加入到下室，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出24孔板，用干燥起來(lái)的棉簽擦拭上室底部表面未穿過膜的細(xì)胞，PBS洗滌2遍后甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，顯微鏡下拍照，隨機(jī)取6個(gè)不同的視野（×200）觀察并記錄穿膜的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算每組小室細(xì)胞的平均數(shù)。

1.2.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力4℃融化Matrigel，于冰上將Matrigel用磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffered saline，PBS）按照1∶8稀釋。把Transwell小室放入24孔板中，取50μL稀釋好的Matrigel鋪在小室內(nèi)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中2～3 h促膠凝固。Transwell上室中分別加入4個(gè)組的細(xì)胞懸液（密度為1×105個(gè)/mL）200μL，下室中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，清洗膜，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色5 min，顯微鏡下拍照，隨機(jī)取6個(gè)不同的視野（×200）觀察并記錄穿膜的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算每組小室細(xì)胞的平均數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)vimentin，N?cadherin蛋白的表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1∶3比例接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，按上述分組法放置培養(yǎng)箱中孵育24 h。取各組HTR?8/SVneo細(xì)胞，根據(jù)總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，用全自動(dòng)生化分析儀（Beckman）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白濃度取適量進(jìn)行SDS?PAGE分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中搖床上封閉2 h，用TBST洗膜10 min，共3次，分別用vimentin、N?cadherin和β?actin的Ⅰ抗按適當(dāng)比例4℃孵育過夜，再洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG孵育2 h，最后洗膜3×10 min，化學(xué)發(fā)光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 ELISA法檢測(cè)MMP?2及 MMP?9表達(dá)水平收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)對(duì)照組、10μmol/L Aβ1?42組及10μmol/L Aβ1?42＋1∶750稀釋抗Aβ1?42抗體組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?2及MMP?9水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 MMP?2/MMP?9活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MMP?2及MMP?9活性水平收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)對(duì)照組、10μmol/L Aβ1?42組及10 μmol/L Aβ1?42＋1∶750稀釋抗Aβ 1?42抗體組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?2及MMP?9活性水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均用Kolmogorov?Smirnov檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)符合正態(tài)性分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)其方差齊性，采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Aβ1?42體外刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞活力的影響采用CCK?8法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，如圖1所示，不同濃度Aβ1?42處理后對(duì)HTR?8/SVneo細(xì)胞活力產(chǎn)生不同影響。與對(duì)照組相比，10μmol/L Aβ1?42處理組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05），15μmol/L及20μmol/L處理組細(xì)胞活力與10μmol/L Aβ1?42處理組無(wú)明顯差異，5μmol/L Aβ1?42處理組對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。

2.2 Aβ1?42體外刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的影響Transwell遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ1?42組HTR?8/SVneo細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）；Aβ1?42＋抗Aβ1?42抗體組細(xì)胞遷移能力高于Aβ 1?42組，與對(duì)照組接近（P＞ 0.05，圖2）。

2.3 Aβ1?42體外刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞N?cadherin、vi?mentin蛋白表達(dá)的影響N?cadherin及vimentin是反映細(xì)胞遷移狀態(tài)的重要指標(biāo)。Aβ1?42處理HTR?8/SVneo細(xì)胞后，N?cadherin、vimentin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降；然而，同時(shí)加入抗Aβ1?42抗體共同處理細(xì)胞后，N?cadherin及vimentin蛋白表達(dá)水平顯著上升（圖3）。

圖1 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細(xì)胞活力Fig.1 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited HTR?8/SVneo cells viability

圖2 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細(xì)胞遷移Fig.2 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited HTR?8/SVneo cells migration ability

圖3 Aβ1?42下調(diào)HTR?8/SVneo細(xì)胞中N?cadherin、vimentin蛋白的表達(dá)Fig.3 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited protein levels of N?cadherin and vimentin in HTR?8/SVneo cells

2.4 Aβ1?42體外刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，Aβ1?42組HTR?8/SV?neo細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）；Aβ1?42＋抗Aβ1?42抗體組細(xì)胞侵襲能力高于Aβ 1?42組，與對(duì)照組接近（P＞ 0.05，圖4）。

圖4 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細(xì)胞侵襲Fig.4 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited HTR?8/SVneo cells invasion ability

2.5 Aβ1?42體外刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞 MMP?2及MMP?9表達(dá)的影響ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?2及MMP?9表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Aβ1?42處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?2及MMP?9的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）；然而，同時(shí)加入抗Aβ1?42抗體共同處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?2及MMP?9表達(dá)水平明顯上升，與對(duì)照組接近（P＞0.05，圖5）。

2.6 Aβ1?42體外刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞 MMP?2及MMP?9活性的影響MMP?2/MMP?9活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MMP?2及MMP?9活性水平，發(fā)現(xiàn)Aβ1?42處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?2及MMP?9活性較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）；然而，同時(shí)加入抗Aβ1?42抗體共同處理細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?2及MMP?9活性明顯上升，與對(duì)照組接近（P＞ 0.05，圖6）。

圖5 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細(xì)胞MMP?2及MMP?9表達(dá)Fig.5 Amyloid β?peptide（1?42）inhibited MMP?2 and MMP?9 expression in HTR?8/SVneo cells

圖6 Aβ1?42抑制HTR?8/SVneo細(xì)胞MMP?2及MMP?9活性Fig.6 Amyloid β?peptide（1?42）decreased MMP?2 and MMP?9 activity in HTR?8/SVneo cells

3 討論

蛋白質(zhì)的正確折疊是確保其形成特定構(gòu)象的關(guān)鍵因素，由于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊發(fā)生構(gòu)象改變，并在機(jī)體內(nèi)異常蓄積而引發(fā)的組織病變稱為蛋白質(zhì)構(gòu)象病［6］。迄今已發(fā)現(xiàn)有20多種蛋白能發(fā)生異常聚集，形成淀粉樣沉淀，導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病等“構(gòu)象病”的發(fā)生［7］。最近研究表明，蛋白錯(cuò)誤折疊與PE的關(guān)系十分密切。BUHIMSCHI、KALKUNTE等研究人員對(duì)PE患者的血清、尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PE患者的血清及尿液中均有多種構(gòu)象錯(cuò)誤蛋白的沉積，如：Aβ、SERPINA1、albumin、interferon?inducible protein 6?16 等［8-9］。而且，PE 患者的胎盤中APP及相關(guān)分泌酶均過量表達(dá)，導(dǎo)致大量寡聚化的Aβ生成并聚集沉淀于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)，其中以42個(gè)氨基酸Aβ寡聚體（Aβ1?42）為主要形式［5］。

Aβ是由淀粉樣前體蛋白（amyloidβ?protein precursor，APP）經(jīng)β?和γ?分泌酶的蛋白水解作用而產(chǎn)生的含有39～43個(gè)氨基酸的多肽，大多與伴侶蛋白分子結(jié)合。Aβ具有寡聚化的特性，容易發(fā)生構(gòu)象錯(cuò)誤，在引起氧化應(yīng)激和神經(jīng)退行性病變中發(fā)揮直接、重要的作用［10］，但Aβ在PE發(fā)病中的具體作用和分子機(jī)制目前尚不明確。既往研究表明，PE患者子宮螺旋動(dòng)脈血管內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量極少，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)子宮螺旋動(dòng)脈的重鑄極其不足，引起管腔狹窄，胎盤發(fā)育不完善［2-3］，因此滋養(yǎng)細(xì)胞生理遷移、侵襲能力下降可能是PE發(fā)病的重要因素［4］。因此本研究利用Aβ1?42 體外刺激HTR?8/SVneo細(xì)胞，深入探討Aβ1?42對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲的影響及其調(diào)控機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1?42處理HTR?8/SVneo細(xì)胞后，細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組顯著降低，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)N?cadherin、vimentin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降。N?cadherin是鈣黏附素家族的主要成員，參與介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)黏附。有研究證實(shí)，N?cadherin及其調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Twist在絨毛膜外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（extravillous cytotropho?blasts，EVT）中高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EVT遷移。通過利用siRNA靶向沉默Twist基因以降低N?cadherin表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移能力明顯下降，提示N?cadherin的高表達(dá)與滋養(yǎng)細(xì)胞的生理浸潤(rùn)和遷移關(guān)系密切［11-13］。vimentin是維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重要蛋白，有研究證實(shí)，上皮來(lái)源腫瘤中出現(xiàn)vimentin的高表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［14］。DU等［15］對(duì)PE孕婦胎盤組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，PE孕婦胎盤組織中vimentin的mRNA及蛋白表達(dá)水平均較正常孕婦胎盤下降，提示vimentin可能在滋養(yǎng)細(xì)胞的生理性浸潤(rùn)中起著重要作用。本研究通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Aβ1?42處理HTR?8/SVneo細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照組顯著下降，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP?2及MMP?9表達(dá)水平、MMP?2/MMP?9活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MMP?2及MMP?9活性，發(fā)現(xiàn)Aβ1?42組MMP?2及MMP?9表達(dá)水平及活性均較對(duì)照組明顯下降。MMP?2、MMP?9是MMPs家族中重要的成員，研究表明，MMP?2、MMP?9與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力、重鑄螺旋動(dòng)脈及胎盤形成過程密切相關(guān)［16-18］。MMP?2、MMP?9被激活后可以形成Ⅳ型膠原酶降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型膠原和明膠，為滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入創(chuàng)造條件［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Aβ1?42抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，可能導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈血管重鑄障礙。

綜上所述，Aβ1?42抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、侵襲能力，可能導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈血管重鑄障礙，為β淀粉樣蛋白在PE的病理發(fā)生中所起的作用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，Aβ1?42對(duì)于滋養(yǎng)細(xì)胞遷移、侵襲能力影響的確切分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。