日本血吸蟲陽性釘螺和陰性釘螺組織切片對比分析

袁飛洲，舒凡帆，吳杰，李朝，石蓮琴，鄒豐才，楊建發(fā)*

（1西雙版納傣族自治州動物疫病預防控制中心，云南 西雙版納 666100；2大理大學農學與生物科學學院，云南 大理 671003；3云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201)

日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）是一種危害嚴重的人畜共患寄生蟲，釘螺作為日本血吸蟲病唯一的中間宿主，對該病的流行傳播發(fā)揮媒介作用，因此，消滅釘螺是控制血吸蟲病主要的措施[1-2]。釘螺的外殼為右螺旋狀的圓錐形，去殼后為軟體組織，軟體組織前部主要包括頭、頸和足，以及外套膜，后面是內臟囊，內臟囊含有各個臟器。肝包括消化腺和性腺，消化腺是橘黃色的大型腺體，與性腺共同占據(jù)了大部分內臟囊。研究表明[3]：由于殼和內臟囊之間有距離，已感染日本血吸蟲釘螺的這個微小距離，可被蟲體寄生導致消化腺腫大的擠壓而消失，同時，病理情況下釘螺肝臟腫大，呈淡棕色或灰白色，表面有許多大小不等、排列不齊的白斑，周圍為被擠壓的褐色肝實質細胞。而釘螺肌纖維正常是呈長紡錘形的平滑肌纖維，核位于細胞中央[4]。

目前關于寄生蟲與宿主之間互作的病理組織切片的報道較少，釘螺相關的僅見有釘螺頭部神經節(jié)病理切片[5]、日本血吸蟲毛蚴在釘螺體內發(fā)育組織切片[6]。劉韜等[7]把感染斯氏艾美爾球蟲兔子的肝臟制作成組織切片，觀察到該蟲裂殖和配子生殖時期的蟲體；王時偉等[8]對感染柔嫩艾美爾球蟲的雞盲腸組織制作成病理切片，觀察發(fā)現(xiàn)盲腸腸絨毛上皮和腸腺及肌層均有蟲體寄生，并發(fā)生出血性病變；王時偉等[9]進行了堆型艾美爾球蟲的分離與病理學探索，結果觀察到腸絨毛斷裂、脫落，在其上皮細胞中發(fā)現(xiàn)蟲體；呂元聰?shù)萚10]把感染弓形蟲的小白鼠臟器組織進行了病理組織切片的制作與觀察，除腦組織未發(fā)現(xiàn)蟲體和病變，其他組織均有蟲體出現(xiàn)，對臨床癥狀不明顯或不足以確診的弓形蟲病，適合采集淋巴結制作成病理組織切片，以觀察是否有滋養(yǎng)體來確診該病。目前，日本血吸蟲毛蚴進入釘螺后，在其體內進行發(fā)育過程而導致的病理變化尚未見報道。

因此，本試驗通過對比分析感染日本血吸蟲的陽性釘螺、陰性釘螺的肌肉和肝臟組織的病理變化，從病理學角度揭示日本血吸蟲對釘螺造成的影響，以期為陽性釘螺的診斷鑒定提供病理學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 釘螺來源

江蘇省血吸蟲病防治研究所饋贈。

1.1.2 主要試劑

滅菌4%生理鹽水，4%多聚甲醛，石蠟，無水乙醇，雙蒸水，二甲苯，中性樹脂等。

1.2 方法

1.2.1 釘螺的鏡檢

將釘螺壓片，棄掉螺殼，通過鏡檢辨別鑒定陽性釘螺和陰性釘螺，步驟如下：

（1）用滅菌4%生理鹽水清洗釘螺3遍。

（2）把釘螺放在潔凈的載玻片上，用另一片載玻片壓碎釘螺，用鑷子棄掉螺殼，加一滴生理鹽水鏡檢。

（3）顯微鏡下觀察是否有日本血吸蟲胞蚴或尾蚴的存在，從而確定陽性和陰性釘螺。

（4）重復上述步驟，完成10只陽性釘螺和10只陰性釘螺的檢測，將沖洗干凈的軟體組織放入裝有4%多聚甲醛的凍存管中浸泡，用于制作組織切片。

1.2.2 組織切片的制作

將新鮮的釘螺軟體組織，按照以下步驟完成組織切片的制作[5]。

（1）固定：將鏡檢后的釘螺組織放在裝有4%多聚甲醛的凍存管中，浸泡72 h，備用。

（2）沖洗：將浸泡過4%多聚甲醛的釘螺組織用紗布包裹好，放入包埋盒中，置于大燒杯里，自來水沖洗2 h。

（3）智能脫水機程序：將自來水沖洗后的釘螺肉，連同包埋盒一同放入智能脫水機中脫水、透明和浸蠟。

（4）包埋：將包埋盒從智能脫水機中取出，拿出釘螺組織，放入石蠟模具中，用生物組織自動包埋機對釘螺組織塊進行包埋，冷卻后切片。

（5）切片和展片：修整包埋好的釘螺組織蠟塊，并固定于切片機上，先粗切，后細切，切片厚度為8 μm，將切好的切片用毛筆蘸取下來，置于溫度為60℃恒溫水浴鍋中，展開，用多賴聚氨酸處理過的載玻片進行撈片，使切片完整且完全展開。

（6）烘片：將樣本切片放入65℃烘箱中，進行烘干，過夜。

（7）HE染色并顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 釘螺鏡檢結果

通過對釘螺進行玻片重壓法解剖，在光學顯微鏡下對其鏡檢，先用20倍鏡觀察是否有蟲體，發(fā)現(xiàn)有蟲體擺動尾部后，用40倍鏡放大觀察蟲體，可確認為日本血吸蟲尾蚴，如圖1所示：20×光學顯微鏡下可見數(shù)條尾蚴由體部和尾部構成，體部呈長橢圓形，尾部具有細長尾干，尾干端部有分叉尾葉；圖2所示：40×光學顯微鏡下可見體部前端有口孔，腹中部表面有腹吸盤，體表有許多單根纖毛的乳頭狀感覺器官。

圖1 尾蚴（20×）Fig.1 Cercariae(20×)

圖2 尾蚴（40×）Fig.2 Cercariae(40×)

2.2 陽性和陰性釘螺組織切片對比

10只陽性釘螺和10只陰性釘螺共20個蠟塊樣本，每個樣本制作2張切片，每個樣本拍攝5張照片，共40張病理組織切片，200張病理組織切片照片。通過對這些組織切片的觀察，發(fā)現(xiàn)陽性釘螺與陰性釘螺的肌肉組織及肝臟的變化（表1）。陽性釘螺肌肉組織會出現(xiàn)色淡、腫脹，部分腫脹至斷裂，肌纖維排列混亂等現(xiàn)象（圖3、圖4）；陰性釘螺肌肉組織則較為飽滿、紅潤，且排列整齊（圖5、圖6）；陽性釘螺肝組織脆弱、易碎，出現(xiàn)充血和水泡樣變性，大量嗜酸性粒細胞的浸潤，大量淋巴細胞和少量巨噬細胞的滲出，肝腺管壁含有豐富的多角形顆粒細胞，位于肝腺管邊緣（圖7、圖8）；陰性釘螺肝細胞胞質飽滿，緊密，管壁上覆有纖毛上皮細胞，呈縱向褶皺（圖 9、圖 10）

表1 陽性釘螺和陰性釘螺組織切片對比Tab.1 Compared of positiveOncomelanias hupensis and negativeOncomelanias hupensistissue sections

圖3 陽性釘螺肌肉組織 (HE 200×)Fig.3 Positive Oncomelania muscle tissue(HE 200×)

圖4 陽性釘螺肌肉組織 (HE 400×)Fig.4 Positive Oncomelania muscle tissue(HE 400×)

圖5 陰性釘螺肌肉組織 (HE 200×)Fig.5 Negative Oncomelania muscle tissue(HE 200×)

圖6 陰性釘螺肌肉組織 (HE 400×)Fig.6 Negative Oncomelania muscle tissue(HE 400×)

圖7 陽性釘螺肝組織 (HE 200×)Fig.7 Positive Oncomelania hepatic tissue(HE 200×)

圖8 陽性釘螺肝組織 (HE 400×)Fig.8 Positive Oncomelania hepatic tissue(HE 400×)

圖9 陰性釘螺肝組織 (HE 200×)Fig.9 Negative Oncomelania hepatic tissue(HE 200×)

圖10 陰性釘螺肝組織 (HE 400×)Fig.10 Negative Oncomelania hepatic tissue(HE 400×)

3 討論

日本血吸蟲毛蚴入侵釘螺軟體后，經過發(fā)育和無性繁殖，最后逸出尾蚴。這個過程包括毛蚴入侵、母胞蚴發(fā)育、子胞蚴發(fā)育、尾蚴成熟逸出等階段，且有明顯的移行過程。夏明儀等[11]應用組織學方法觀察，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲毛蚴除了入侵皮膚途徑外，至少57%的毛蚴是從釘螺本身的空口鉆入。舒利民[12]對釘螺感染日本血吸蟲毛蚴后，采用組織學檢測方法就毛蚴對釘螺的鉆穿及在釘螺體內分布和移行進行了研究，發(fā)現(xiàn)毛蚴鉆穿主要是在釘螺鰓部、頭足部的表皮和實質組織。毛蚴入侵釘螺體內并完成定位的過程，也是其完成從毛蚴轉變至母胞蚴的過程。母胞蚴在釘螺體內經過無性繁殖階段產生子胞蚴，并在釘螺體內移行至消化腺，也就是最終的肝臟寄生部位。

本試驗采用組織切片實驗技術，對陽性釘螺和陰性釘螺組織切片進行制作與對比分析，初步獲悉了日本血吸蟲與釘螺互作過程中，釘螺肝臟組織與肌肉組織的病理變化。相對于陰性釘螺感染的螺肌肉，陽性釘螺肌肉出現(xiàn)色淡，腫脹可能是由于尾蚴發(fā)育需要吮吸釘螺血液，肌纖維腫脹斷裂，排列混亂是由于尾蚴在釘螺肌肉內部進行游走移行，破壞了肌纖維結構，給釘螺帶來一定損害。同時，陽性釘螺肝臟細胞出現(xiàn)水泡樣變性，可能是由于釘螺肝臟是抗尾蚴入侵的重要部位，發(fā)生了強烈的炎癥反應。陽性釘螺肝臟出現(xiàn)的大量白細胞，如嗜酸性粒細胞浸潤，大量淋巴細胞和少量巨噬細胞也提示釘螺肝臟處發(fā)生了炎癥反應。陽性釘螺組織切片中觀察到嗜酸性粒細胞，引起嗜酸性粒細胞增多的感染性疾病主要為寄生蟲感染[13]，且日本血吸蟲對嗜酸性粒細胞有明顯趨化作用[14]。而淋巴細胞增多后，具有對趨化性刺激做出直接反應的能力，通過吞噬、胞飲和細胞毒性反應等方式來排除異己，即釘螺通過內部防御系統(tǒng)對入侵的血吸蟲幼蟲進行攻擊。

通過本次試驗，初步獲悉了陽性釘螺組織的病理變化，并且從病理學角度探索日本血吸蟲與釘螺互作的影響，為陽性釘螺的診斷鑒定提供病理學方面的參考。