膽汁對(duì)體外培養(yǎng)人細(xì)粒棘球蚴原頭蚴生長(zhǎng)發(fā)育的影響

郭煒，王朝陽(yáng)，于云寶，雷振，朱東陽(yáng)，劉國(guó)生，吳向未，彭心宇，張宏偉*

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆 石河子 832002）

細(xì)粒棘球蚴?。╡chinococcosis）又稱為囊性包蟲(chóng)?。╟ystic echinococcosis，CE）是包蟲(chóng)病的最常見(jiàn)類型，由細(xì)粒棘球蚴絳蟲(chóng)的續(xù)絳期幼蟲(chóng)寄生于人體及某些動(dòng)物體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的人畜共患慢性寄生蟲(chóng)病[1-2]，多發(fā)于肝臟，呈世界性分布，新疆是高發(fā)區(qū)，其流行趨勢(shì)嚴(yán)重，是牧區(qū)“因病致貧、因病返貧”的重要原因之一[3]。目前，肝包蟲(chóng)病的感染途徑以及治療方案的選擇已非常熟悉[4]，但其自然病程即包蟲(chóng)在人體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育到衰老死亡的過(guò)程，目前尚不清楚。

根據(jù)WHO影像學(xué)分型[5]，包蟲(chóng)活性逐漸降低，鈣化包蟲(chóng)認(rèn)為是死亡包蟲(chóng)。包蟲(chóng)在體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，面臨諸多因素如：營(yíng)養(yǎng)、膽瘺、感染等，這些因素均可影響到包蟲(chóng)囊腫的發(fā)育。在包蟲(chóng)漫長(zhǎng)的生長(zhǎng)過(guò)程中，包蟲(chóng)所處的環(huán)境惡化，包蟲(chóng)會(huì)逐漸走向死亡。楊宏強(qiáng)等[6]報(bào)道一組行“肝包蟲(chóng)囊腫‘外膜’內(nèi)完整摘除術(shù)”治療的172例囊性肝包蟲(chóng)病例中，術(shù)中證實(shí)合并膽瘺的病例47例，占27.33%。臨床觀察發(fā)現(xiàn)囊性肝包蟲(chóng)病合并膽瘺時(shí)，囊腫整體活性多處于過(guò)度階段(III/IV型)，屬趨向死亡階段。膽汁是不是包蟲(chóng)死亡的啟動(dòng)因素之一。目前尚不清楚。本研究通過(guò)模擬膽瘺形成膽汁進(jìn)入囊內(nèi)原頭蚴生活的微環(huán)境，體外培養(yǎng)人細(xì)粒棘球蚴原頭蚴，觀察原頭蚴的生長(zhǎng)發(fā)育情況，從實(shí)驗(yàn)室研究角度，初步探討膽汁對(duì)包蟲(chóng)原頭蚴及幼囊的體外作用，為進(jìn)一步研究包蟲(chóng)病的自然病程提供一些理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 人細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的采集

選擇采用開(kāi)放式外膜內(nèi)完整摘除術(shù)手術(shù)的包蟲(chóng)病患者，取出內(nèi)囊，用含雙抗的PBS液沖洗三遍，收集沉淀，棄上清，將收集的沉淀在37℃下，用1%的胃蛋白酶（GIBCO）作用20 min，消化組織塊再用PBS液沖洗3遍，沉淀原頭蚴，去除PBS液。

1.2 膽汁的采集

膽汁來(lái)源于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科。方法：（1）術(shù)中用30 mL無(wú)菌注射器從膽囊息肉患者的膽囊中抽取膽汁，放入高壓過(guò)的無(wú)菌瓶備用。（2）收集我科做T管引流病人的膽汁，選取顏色清亮，無(wú)污染的膽汁。將收集的膽汁各取5 mL按常規(guī)及時(shí)接種于血平板(英國(guó)，OXOID 公司)上，35℃孵育24 h，若無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 原頭蚴的活性檢測(cè)

取消化之后的原頭蚴孵育在培養(yǎng)液中，置于倒置顯微鏡下觀察原頭蚴的活性和形狀。用0.1%伊紅染色，3 min后在倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)活力（活的原頭蚴不著色，活力差或死亡的原頭蚴染成紅色）分別計(jì)數(shù)不染色活原頭蚴和染色的死原頭蚴數(shù)，活力達(dá)90%以上才可用于原頭蚴的培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，Ⅰ組為純膽囊膽汁組，Ⅱ組為RPMI-1640＋肝內(nèi)膽汁（2∶1）組，Ⅲ組為 RPMI-1640組，各組體積為5 mL。每組以2000枚/mL的濃度分別加入原頭蚴。

1.5 原頭蚴的培養(yǎng)

將處理好的原頭蚴用PBS液稀釋至合適體積，混勻從中抽取5 μL至于載玻片，在倒置顯微鏡下記錄活原頭蚴數(shù)，重復(fù)3次，最后求出平均值，然后算出總數(shù)和濃度。按上述分組和濃度，分別將原頭蚴置于各組培養(yǎng)液中。在37℃條件下，5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。

1.6 觀察指標(biāo)及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

每天抽取50 μL原頭蚴，用0.1%伊紅染色10 min后，在倒置顯微鏡下（隨機(jī)選擇3個(gè)視野）觀察視野內(nèi)原頭蚴的外觀及內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰度變化，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1、表2。觀察原頭蚴的活動(dòng)情況，用公式“原頭蚴的活動(dòng)度=活動(dòng)的原頭蚴÷成活原頭蚴總數(shù)”；“頂泡形成率=出現(xiàn)頂泡的活原頭蚴數(shù)÷成活原頭蚴總數(shù)”，計(jì)算出頂泡形成率。利用公式“頭節(jié)外翻率=頭節(jié)外翻的活原頭蚴數(shù)÷成活原頭蚴總數(shù)”，計(jì)算出頭節(jié)外翻率。繪出原頭蚴的生長(zhǎng)曲線圖。

表1 外觀度評(píng)分Tab.1 The score of appenrance

表2 內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰度評(píng)分Tab.2 The score of internal structural clarity

2 結(jié)果

2.1 各組原頭蚴外觀及內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰度

Ⅰ組中95%原頭蚴在第9天其外觀及內(nèi)部結(jié)構(gòu)完全破壞，而Ⅱ組和Ⅲ組中80%原頭蚴第14天仍可觀察到具有較好的外觀及內(nèi)部結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2 原頭蚴活動(dòng)度情況

Ⅰ組中原頭蚴在膽汁的刺激下第1天活動(dòng)度達(dá)60%，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，在第6天活動(dòng)度逐漸降低；Ⅱ組中的原頭蚴隨著能量耗竭，在第7天活動(dòng)度逐漸下降。而Ⅲ組中原頭蚴隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在顯微鏡下可見(jiàn)更多的原頭蚴蠕動(dòng)，活動(dòng)度逐漸增加（圖2）。

圖1 體外培養(yǎng)人細(xì)粒棘球蚴原頭蚴外觀及內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰度評(píng)分Fig.1 Appearance and internal structure clarity score of humanEchinococcus granulosusin vitro

圖2 原頭蚴活動(dòng)度情況Fig.2 The activity of the E.granulosus protoscoleces

2.3 原頭蚴頂泡形成情況

在培養(yǎng)過(guò)程中Ⅱ組和Ⅲ組中的原頭蚴分別在第5天和第4天開(kāi)始出現(xiàn)頂泡，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)頂泡的原頭蚴數(shù)量逐漸增加，而Ⅰ組中的原頭蚴沒(méi)有頂泡的形成（圖3）。

2.4 原頭蚴頭節(jié)外翻情況

3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中原頭蚴的頭節(jié)外翻率均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)外翻率逐漸增加。在培養(yǎng)前，大部分原頭蚴頭節(jié)內(nèi)陷，頂突和小鉤鑲嵌于原頭蚴的體內(nèi)，同時(shí)可看見(jiàn)原頭蚴體內(nèi)有很多鈣顆粒，經(jīng)染色后呈黑色的小點(diǎn)狀。原頭蚴形狀呈梨形或橢圓形。原頭蚴培養(yǎng)至第6天時(shí)，原頭蚴頭節(jié)外翻率較高，可看到原頭蚴的頂突、小鉤和4個(gè)吸盤(pán)，外翻的原頭蚴可看 到頂突和吸盤(pán)有明顯伸縮的運(yùn)動(dòng)（圖4）。

圖3 原頭蚴頂泡的形成Fig.3 The formation of the top bubble

圖4 原頭蚴頭節(jié)外翻率Fig.4 The rate of the first section of valgus

2.5 膽汁刺激下原頭蚴的生長(zhǎng)情況及原頭蚴成囊發(fā)育

通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)觀察，Ⅰ組中原頭蚴在膽汁的刺激下活動(dòng)度增加，外翻頭節(jié)數(shù)量增加。

第14天時(shí)可觀察到視野中的原頭蚴體積明顯縮小，對(duì)伊紅染色無(wú)排斥力，形狀變得不規(guī)則，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰，鈣顆粒消失，外翻的原頭蚴頭鉤脫落或排列紊亂，大部分原頭蚴死亡，無(wú)成囊發(fā)育的原頭蚴（圖 5）。

圖5 Ⅰ組中原頭蚴第6天、第14天發(fā)育情況（×50）Fig.5 The development of protoscoleces at day 6、at day 14 in group Ⅰ(×50)

Ⅱ組中大部分原頭蚴體積縮小，頭節(jié)內(nèi)陷，死亡的原頭蚴數(shù)量增加，僅少量培養(yǎng)的原頭蚴成囊，囊的體積明顯小于同階段Ⅲ組中原頭蚴的囊的體積（圖 6A）。

第Ⅲ組中原頭蚴逐漸向囊方向發(fā)育，頂突和小鉤鑲嵌在囊上，頂突開(kāi)始萎縮，吸盤(pán)逐漸退化甚至消失，原頭蚴體內(nèi)的鈣顆粒消失，原頭蚴呈肥大略透明的冬瓜狀或葫蘆狀(圖6B)

圖6 Ⅱ、Ⅲ組原頭蚴第23天發(fā)育情況（×50）Fig.6 The development of protoscoleces on day 23 in group Ⅱ、Ⅲ(× 50)

3 討論

課題組前期將體外用膽汁處理過(guò)的原頭蚴接種于小鼠腹腔，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠體內(nèi)的囊腫生長(zhǎng)受到抑制。但由于僅僅模擬了一次膽瘺現(xiàn)象，并不能清楚解釋膽汁長(zhǎng)時(shí)間作用于原頭蚴對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響，因此，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)，模擬膽瘺發(fā)生后膽汁進(jìn)入人包蟲(chóng)囊腫內(nèi)原頭蚴生活的微環(huán)境，體外觀察膽汁對(duì)人原頭蚴生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)Ⅰ組及Ⅱ組中的原頭蚴較Ⅲ組中的原頭蚴生長(zhǎng)緩慢，尤其是Ⅰ組中95%原頭蚴在第9天其外觀及內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了嚴(yán)重的損害；Ⅰ組和Ⅱ組中的原頭蚴在膽汁的刺激下活動(dòng)度較Ⅲ組明顯增加，但隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，能量的耗竭其活動(dòng)度下降；Ⅰ組和Ⅱ組中原頭蚴的體積也較培養(yǎng)前明顯縮小，死亡原頭蚴的數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。說(shuō)明純膽汁對(duì)原頭蚴的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，長(zhǎng)時(shí)間的作用能夠破壞原頭蚴的形態(tài)結(jié)構(gòu)，造成其死亡。同時(shí)我們也觀察到在培養(yǎng)第14 d純膽汁培養(yǎng)組仍有少量存活的原頭蚴，也進(jìn)一步證實(shí)了膽汁并不能直接殺死原頭蚴，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)可能會(huì)加速原頭蚴的死亡，從另一方面也說(shuō)明了，原頭蚴具有極強(qiáng)的生命力，在惡劣的條件下仍可存活。與孫馮等[7]研究發(fā)現(xiàn)100%膽汁作用于羊肝細(xì)粒棘球蚴原頭蚴4 d后原頭蚴的死亡率達(dá)100%的結(jié)果不一致，可能膽汁來(lái)源不同，對(duì)不同宿主來(lái)源的原頭蚴的作用不同。J.D.Symth等[8-9]也研究發(fā)現(xiàn)不同宿主膽汁成分對(duì)包蟲(chóng)的作用不同。

Zhang等[10-11]利用RPMI-1640為主的培養(yǎng)液對(duì)羊細(xì)粒棘球蚴原頭蚴體外培養(yǎng)觀察其生長(zhǎng)變化，第14天開(kāi)始向囊方向發(fā)育，第56天，約有10%的原頭蚴發(fā)育成外周有一層薄薄的角質(zhì)層囊。我們?cè)谶B續(xù)培養(yǎng)觀察原頭蚴的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，Ⅰ組中的原頭蚴還沒(méi)有向成囊發(fā)育時(shí)已死亡，而Ⅱ組和Ⅲ組中的原頭蚴均有向成囊發(fā)育，在培養(yǎng)的第20天時(shí)可以觀察到原頭蚴頂突和小鉤鑲嵌在囊上，頂突開(kāi)始萎縮，原頭蚴體內(nèi)的鈣顆粒消失，成半透明狀，形態(tài)各異呈葫蘆形、圓形、橢圓形等。Ⅲ組中原頭蚴變化更為明顯。對(duì)比Ⅲ組中原頭蚴的變化，Ⅱ組中成囊發(fā)育的原頭蚴的數(shù)量明顯減少，成囊發(fā)育的時(shí)間滯后，囊的體積較小，頭節(jié)內(nèi)陷，大部分死亡。進(jìn)一步證明膽汁可以抑制原頭蚴成囊發(fā)育，但不能完全阻止其發(fā)育，也就是說(shuō)，在真實(shí)的人體環(huán)境內(nèi)，即便發(fā)生膽瘺，膽汁進(jìn)入到包蟲(chóng)囊腫內(nèi)，也不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)將所有的原頭蚴殺滅，部分原頭蚴在條件改變后仍可發(fā)育為獨(dú)立的囊（子囊），也可解釋有膽瘺存在的包蟲(chóng)囊腫可呈現(xiàn)多子囊表現(xiàn)的臨床現(xiàn)象。

世界衛(wèi)生組織把囊性肝包蟲(chóng)病根據(jù)其影像學(xué)特征分六型：囊型病灶型（CL型）、單囊型（I型）、多子囊型（II型）、內(nèi)囊破裂型（III型）、實(shí)變型（IV型）、鈣化型（V型），并由此確定囊性肝包蟲(chóng)病在體內(nèi)的自然病程變化也遵循從CL型到V型的變化過(guò)程，病程長(zhǎng)達(dá)十幾年[12]。資料表明CL型、I型、II型囊內(nèi)包蟲(chóng)具有活性，III型囊內(nèi)包蟲(chóng)部分有活性，部分已經(jīng)死亡，IV型、V型囊內(nèi)包蟲(chóng)沒(méi)有活性，已經(jīng)死亡。馬志剛等[13]研究發(fā)現(xiàn)囊型肝包蟲(chóng)病囊腫分型從CL型向V型演變，膽瘺發(fā)生率逐漸增高。且原頭蚴的活性和發(fā)育能力與膽瘺的發(fā)生率成負(fù)相關(guān)。因此可推斷，膽汁進(jìn)入到囊腫內(nèi)后，不能完全殺死頭節(jié)，部分頭節(jié)形成子囊，并逐漸發(fā)育，最終由于營(yíng)養(yǎng)耗竭或持續(xù)膽汁刺激而發(fā)生子囊破裂，其內(nèi)原頭蚴繼續(xù)成囊發(fā)育，周而復(fù)始，導(dǎo)致包蟲(chóng)在有限的空間內(nèi)不斷繁衍生存，此過(guò)程中，膽汁內(nèi)細(xì)菌的作用可能較弱，雖有研究者認(rèn)為[14-15]肝包蟲(chóng)的外囊壁包埋著許多小膽管，長(zhǎng)期壓迫可導(dǎo)致發(fā)生膽瘺，膽道中細(xì)菌隨膽汁進(jìn)入包蟲(chóng)囊內(nèi)而引起感染，進(jìn)一步導(dǎo)致包蟲(chóng)死亡。我團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可導(dǎo)致包蟲(chóng)原頭蚴的迅速死亡。

本實(shí)驗(yàn)只能在一定程度上反映了人膽汁對(duì)人肝包蟲(chóng)原頭蚴的生長(zhǎng)發(fā)育作用，但是不能真實(shí)的模擬包蟲(chóng)膽瘺發(fā)生以后，包蟲(chóng)囊腫的病理生理學(xué)變化，因?yàn)榇诉^(guò)程極為漫長(zhǎng)，因此，包蟲(chóng)在人體動(dòng)態(tài)變化的環(huán)境中是如何發(fā)展變化的還有待進(jìn)一步研究。