鵝脫氧膽酸誘導細粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡作用機制的初步研究

湯光耀，李佳潔，馬斌，姜玉峰，呂海龍*

（1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆 石河子832008；2石河子大學醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學教研室，新疆 石河子832008）

細粒棘球蚴?。╟ystic echinococcosis，CE）又稱囊型包蟲?。╡chinococcosis），是由細粒棘球絳蟲（Echinococcosis granulosus，Eg）的幼蟲階段寄生于人體或者宿主動物而引起的疾病，主要流行于新疆等畜牧業(yè)發(fā)達的地區(qū)[1]。細粒棘球蚴病主要發(fā)生在肝臟，治療上以手術(shù)為主。膽瘺是囊型肝包蟲病最常見的并發(fā)癥[2-3]，本課題組[4]在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，肝細粒棘球蚴病合并膽瘺患者包蟲內(nèi)原頭節(jié)大部分已經(jīng)死亡，并且肝包蟲進入膽道后原頭節(jié)無法發(fā)育成包蟲。因此推測膽汁進入囊型肝包蟲囊內(nèi)是導致囊型肝包蟲死亡的原因之一。孫馮等[5]將不同濃度膽汁體外作用于細粒棘球蚴原頭節(jié)觀察到膽汁可抑制原頭節(jié)的活力。膽汁包含許多成分，具體哪種成分導致細粒棘球蚴原頭節(jié)的死亡，目前并不清楚。膽汁酸是膽汁的主要成分，膽汁酸具有細胞毒性，可以破壞細胞膜的完整性，促進活性氧的產(chǎn)生并氧化修飾蛋白等細胞成分，高濃度膽汁酸可引起肝細胞變形壞死[6]。研究發(fā)現(xiàn)，疏水性膽汁酸可通過線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、死亡受體途徑誘導肝細胞凋亡和壞死[7]。本課題組史紅娟等[8]使用不同濃度鵝脫氧膽酸體外作用于原頭節(jié)，發(fā)現(xiàn)鵝脫氧膽酸能夠誘導細粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡，并具有時間和濃度關(guān)系。但具體鵝脫氧膽酸通過何種機制誘導原頭節(jié)凋亡并不明確。本實驗擬采用鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）體外作用于細粒棘球蚴原頭節(jié)，檢測鵝脫氧膽酸對細粒棘球蚴原頭節(jié)活力的變化，并通過檢測氧化-抗氧化相關(guān)蛋白水平變化，初步探討鵝脫氧膽酸誘導原頭節(jié)凋亡的作用機制，以期為臨床發(fā)現(xiàn)新型抗包蟲藥提供一種理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

含細粒棘球蚴囊泡的羊肝買自昌吉屠宰場。鵝脫氧膽酸購于美國sigma公司；Nrf2多克隆抗體購自美國 abcam公司；Caspase-3、ROS、GSH-PX和 TPX檢測試劑盒均購于南京建成公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自上海哈靈生物公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 原頭節(jié)的體外培養(yǎng)

獲取含細粒棘球蚴病囊泡的羊肝，用雙蒸水及75%酒精分別清洗肝臟囊泡表面，在無菌條件下抽取含原頭節(jié)的囊液置于培養(yǎng)瓶中，靜置，抽掉上清，用 PBS(PH7.2)液洗滌4～6遍，用0.1%伊紅染液做染色排斥實驗，98%以上拒染時可用于實驗。將原頭節(jié)移至含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基（青霉素及鏈霉素各100 U/mL）的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 CDCA作用于細粒棘球蚴原頭節(jié)

將原頭節(jié)分為空白對照組及 500、1000、2000、3000 μmol/L CDCA 組。于無菌條件下用PBS清洗體外培養(yǎng)后的細粒棘球蚴原頭節(jié)至其活力≥98%；取六孔板，按照設(shè)置好的體系及分組加入相應培養(yǎng)基，每組培養(yǎng)基中加入約2500個原頭節(jié)，放于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，從加藥24 h開始，每天抽取100 μL培養(yǎng)液，用0.1%伊紅染色法檢測原頭節(jié)活力并在倒置顯微鏡下觀察計數(shù)。無活力或者活力差的原頭節(jié)會被染成紅色；活力較好的頭節(jié)不被染色，且可活動。間隔3天更換培養(yǎng)液，重新加藥。實驗重復3次。

1.4 Caspase-3的酶活力測定

取空白組及1000、3000 μmol/L CDCA組作用24、48 h后的細粒棘球蚴原頭節(jié)，PBS清洗3次后。每3 mg原頭節(jié)中加入120 μL裂解液，超聲破碎（功率、時間、次數(shù)），4℃12000 g高速離心10 min后，抽取上清液。按照 Caspase-3檢測試劑盒步驟將反應體系加入96孔板中，于37℃避光孵育，待顏色變化較明顯時，用 Bio-RAD酶標儀檢測吸光度(A405值)。實驗重復3次。

1.5 ROS水平的測定

收集空白組及 1000、3000 μmol/L CDCA 組作用2、4 d后的原頭節(jié)，更換含DCFH-DA 10 μmol/L無血清培養(yǎng)基，37℃避光孵育1 h，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，靜置，待自然沉淀后收集原頭節(jié)，用Bio-RAD熒光酶標儀檢測DCFH OD值，488 nm激發(fā)波長，525nm 發(fā)射波。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測Nrf2蛋白的表達

收集不同濃度CDCA處理后的原頭節(jié)。用含PMSF（1∶100）的 RIPA裂解緩沖液在冰上裂解 15分鐘，用細胞超聲破碎機粉碎，4℃ 12000 g離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。1∶4比例加 5×上樣緩沖液，100℃煮沸樣品 9min，SDS-PAGE分離目標蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)膜至 PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的 PBST封閉2 h，4℃一抗孵育過夜，用 PBST漂洗3次，二抗孵育3 h，用PBST漂洗3次后用 ECL發(fā)光液暗室顯影1～3 min。ImageJ軟件測算β-actin蛋白灰度值與目的蛋白灰度值的比值，并計算目的蛋白的相對表達量。

1.7 抗氧化酶GSH-Px和TPx活性的測定

分別取空白組及1000、3000 μmol/L CDCA 作用2、4 d的原頭節(jié)，按照GSH-Px和TPx檢測試劑盒中所述方法提取原頭節(jié)蛋白，并用超微量紫外可見分光光度計測定蛋白濃度。取上清液，按照 GSH-Px和TPx檢測試劑盒使用說明書方法檢測原頭節(jié)抗氧化酶活性；用超微量紫外可見分光光度計檢測OD值。實驗獨立重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和最小顯著差法(LSD)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CDCA作用原頭節(jié)后活力的變化

CDCA 作用后的原頭節(jié)活力曲線（圖1）。隨著時間的延長，同一藥物濃度下原頭節(jié)存活率逐漸降低；在同一時間下，隨著藥物濃度的增加，原頭節(jié)存活率也降低。由此表明CDCA誘導原頭節(jié)死亡具有時間和濃度依賴性。

圖1 CDCA作用后原頭節(jié)的活力變化Fig.1 Survival of E.granulosus protoscoleces after in vitro exposure to CDCA

2.2 CDCA作用后原頭節(jié)體內(nèi)Caspase-3酶活性的變化

體外培養(yǎng)24、48 h后的各組原頭節(jié)分別進行caspase-3酶活性檢測，結(jié)果如圖2所示。在相同時間內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，caspase-3酶活性逐漸增強，CDCA作用組同空白組比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

對 Caspase-3酶活性檢測數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間比較有統(tǒng)計學意義（F=655.038，P＜0.05），以 3000 μmol/L CDCA 濃度組 caspase-3酶活性增加更顯著。

圖2 CDCA作用24、48 h后原頭節(jié)caspase-3酶活性變化Fig.2 Activity of caspase-3 in E.granulosus protoscoleces incubated with CDCA for 24 h and 48 h

2.3 CDCA作用后原頭節(jié)內(nèi)ROS水平的變化

CDCA 處理原頭節(jié)2、4 d，采用 DCFH-DA 熒光染色后，CDCA組原頭節(jié)可見綠色熒光，ROS的熒光強度變化見圖3，熒光酶標儀檢測顯示終濃度1000、3000 μmol/L CDCA 作用 2 d后 ROS 熒光強度分別為對照組 2.47、3.83倍；作用 4 d后ROS熒光強度分別為對照組 3.560、4.91倍。由圖3可見ROS隨CDCA藥物濃度的增加和作用時間的延長，ROS水平明顯升高，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義(F=1631.77，P＜0.05)。

圖3 CDCA作用2、4 d后原頭節(jié)ROS水平變化Fig 3.Impact of CDCA on ROS level in E.granulosus protoscoleces after 2 d and 4 d post-incubation

2.4 CDCA抑制Nrf2蛋白的表達

利用western blot技術(shù)檢測Nrf2蛋白的表達（圖4），發(fā)現(xiàn)與對照組相比，1000、3000 μmol/L CDCA作用2 d后可見Nrf2蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；隨著時間的延長，作用4 d后可見Nrf2蛋白的表達明顯降低，說明CDCA可抑制Nrf2蛋白的表達，破壞了抗氧化防御系統(tǒng)。

圖4 CDCA作用2、4 d后原頭節(jié)內(nèi)Nrf2蛋白的表達情況Fig.4 Level of Nrf2 protein in E.granulosus protoscoleces incubated with CDCA for 2 d and 4 d

2.5 CDCA對細粒棘球蚴原頭節(jié)抗氧化物酶GSH-Px和TPx酶活性的影響

CDCA處理原頭節(jié)后GSH-Px和TPx酶活性檢測結(jié)果見圖 5，1000、3000 μmol/L CDCA 作用后的原頭節(jié)與空白組相比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=756.033、608.848，P<0.05）。 1000μmol/L CDCA作用原頭節(jié)2、4 d后 GSH-Px和TPx的活性降低，采用單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（F=756.033、608.848，P<0.05）。3000 μmol/L CDCA 組GSH-Px和TPx活性呈現(xiàn)類似的變化趨勢。

圖5 CDCA作用2、4 d后原頭節(jié)內(nèi)GSH-Px和TPx酶活性的變化Fig.5 Impact of CDCA on GSH-Px and TPx activity in E.granulosus protoscoleces after 2d and 4d post-incubation

3 討論

手術(shù)過程中原頭節(jié)外溢是細粒棘球蚴病復發(fā)的主要原因[9]，因此術(shù)中使用有效的化學藥物是極其有必要的[10]，但目前尚未報道既有效又安全的化學藥物[11]。有關(guān)實驗證實[8]，CDCA能夠誘導細粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡，但具體通過何種機制誘導原頭節(jié)凋亡并不明確。

本實驗結(jié)果顯示隨著CDCA濃度增加體外抑制細粒棘球蚴原頭節(jié)的作用越明顯，這同本課題組前期研究具有一致性[8]。原頭節(jié)的活力曲線顯示3000 μmol/L CDCA對原頭節(jié)的抑制作用顯著強于其他低濃度組 （1000、2000μmol/L CDCA）。此外 2000 μmol/L CDCA 作用2d時原頭節(jié)的存活率為85%，作用4 d時其存活率下降到76%。提示CDCA具有潛在的抗肝囊性包蟲病作用。

細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，是機體的一種自我調(diào)節(jié)方式，而當機體的這種調(diào)節(jié)方式被破壞時則會誘發(fā)疾病的產(chǎn)生。在不同的病理過程中，由于許多的分子信號通路均可調(diào)節(jié)caspase-3，故caspase-3通常被當做凋亡的關(guān)鍵蛋白。本實驗應用鵝脫氧膽酸體外作用于細粒棘球蚴原頭節(jié)，觀察到鵝脫氧膽酸能誘導原頭節(jié)的凋亡，使caspase-3的酶活性升高，這與相關(guān)文獻[8]的研究結(jié)果類似，進一步驗證了鵝脫氧膽酸可抑制原頭節(jié)的生長并可誘導原頭節(jié)凋亡。

氧化應激（Oxygen stress）主要是通過使膜脂質(zhì)過氧化從而改變生物膜功能并破壞酶的活性而引起不同程度的細胞損傷，甚至誘導細胞凋亡。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子 2（Nuclear factor E2-related fator 2，Nrf2）是細胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，主要存在如肝臟、皮膚[12]等代謝器官中，可參與維持氧化還原平衡、凋亡等過程[13]。Nrf2是細胞抗氧化應激的關(guān)鍵因子，在細胞質(zhì)中與Keap1相結(jié)合，能夠使細胞逃避不良刺激。

有關(guān)實驗表明[14]，膽汁酸具有的細胞毒性能破壞細胞質(zhì)膜，誘導細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，而 ROS可進一步增強膽汁酸的細胞毒性作用，最終誘導細胞的凋亡。有關(guān)研究表明[15]，在體外研究條件下，過量的ROS能夠?qū)е戮€粒體結(jié)構(gòu)受損，產(chǎn)生凋亡誘導因子，從而激活下游的caspase途徑，最終激活caspase-3誘導細胞凋亡。而Nrf2主要是通過抑制線粒體途徑起到抗凋亡作用[16]。Nrf2可被外界和內(nèi)部多種刺激因子激活，當受到ROS的刺激后，Nrf2被磷酸化并與Keap1解離[17]，之后磷酸化的Nrf2轉(zhuǎn)位進入細胞核，啟動下游抗氧化酶GSH-Px和TPx等基因的轉(zhuǎn)錄，這些酶和蛋白可滅活內(nèi)源性ROS，避免ROS濃度過高誘發(fā)的細胞損傷[18]，但當ROS濃度超過機體的抗氧化系統(tǒng)的防御機制時，就會導致抗氧化系統(tǒng)破壞，會誘導細胞發(fā)生凋亡[17]。

在本研究中，我們觀察到細粒棘球蚴原頭節(jié)早期就能夠產(chǎn)生ROS。在用 CDCA處理后2、4 d后，我們觀察到細粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)ROS明顯增加，并且隨著CDCA藥物濃度的增加和作用時間的延長，原頭節(jié)內(nèi) ROS的水平也明顯的升高，說明CDCA能夠?qū)е略^節(jié)出現(xiàn)氧化損傷；同時western blot檢測到原頭節(jié)內(nèi)Nrf2蛋白的表達降低，抗氧化物酶試劑盒檢測到其下游基因GSH-Px和TPx的表達也降低，并且具有濃度與時間關(guān)系。

目前，許多研究證實氧化應激與腫瘤細胞凋亡之間存在聯(lián)系，細胞內(nèi)ROS水平的變化可引起凋亡相關(guān)信號通路發(fā)生變化，可最終激活caspase-3，誘導細胞凋亡[19]。本實驗結(jié)果證實氧化應激參與CDCA誘導原頭節(jié)凋亡的過程中，這提示CDCA誘導細粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡可能是通過氧化應激途徑起作用的，但進一步的作用途徑的有待下一步研究探討。