BMP7治療大鼠脊髓損傷后NF200及GFAP表達(dá)的變化

張玉玲，白廣超，金宏亮，張文，李寬新

（1新疆兵團(tuán)醫(yī)院教學(xué)科，新疆 烏魯木齊 830000；2新疆兵團(tuán)醫(yī)院關(guān)節(jié)脊柱外科,新疆 烏魯木齊 830000）

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）是一種具有高發(fā)生率、高致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]，由于神經(jīng)元細(xì)胞為不可再生細(xì)胞，損傷壞死的神經(jīng)元細(xì)胞得不到補(bǔ)充，常規(guī)的手術(shù)+激素治療方法并不能取得良好的治療效果，故脊髓損傷后神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)及修復(fù)成為脊髓損傷治療的研究熱點(diǎn)[2]。目前研究表明，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）超家族的BMP7具有神經(jīng)保護(hù)及促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的作用[3]。

因此，本研究于 2016年1-8月，使用BMP7治療急性大鼠脊髓損傷，檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況及神經(jīng)修復(fù)標(biāo)志蛋白表達(dá)量的變化，以探索BMP7促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠70只，4周齡，體重約120 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、飲水，所有實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 主要試劑

BMP7（美國(guó)R＆D公司），0.9%氯化鈉注射液（新疆華世丹藥業(yè)有限公司），10%水合氯醛（上海聯(lián)碩生物科技有限公司），大鼠NF200單克隆抗體、大鼠GFAP單克隆抗體（Wako公司，日本），羊抗鼠的IgG-HRP（上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），蘇木素復(fù)染液（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司），中性樹膠（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器

動(dòng)物手術(shù)器械（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）、Allences′s打擊器（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科中心提供）、0.1 mm聚乙烯導(dǎo)管（上海桑戈生物科技有限公司）、光學(xué)顯微鏡E100（日本Nikon）、石蠟包埋機(jī)及切片機(jī)（東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司）、純水器（成都超純公司）、烘箱（北京昊諾斯科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠急性脊髓損傷模型的建立

把Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和BMP7實(shí)驗(yàn)組，每組30只，10只備用。每只大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉（每100 g體重30 mg水合氯醛），術(shù)區(qū)碘伏消毒，以背正中切口暴露出第10胸椎硬脊膜，使用Allences′s打擊器以15 g×20 cm的能量打擊第10胸椎脊髓處，局部可見出血、水腫，大鼠出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)，軀體回縮撲動(dòng)，雙后肢遲緩性癱瘓，表明造模成功[4]。隨后把0.1 mm聚乙烯導(dǎo)管植入損傷處蛛網(wǎng)膜下，逐層縫合切口。術(shù)后連續(xù)3 d每天肌注4萬U青霉素，每天給予2次膀胱按壓輔助排尿直至自主排尿功能恢復(fù)，把BMP7粉末以超純水溶解，制成濃度為500 ng/mL的BMP7溶液，0.1 mm聚乙烯導(dǎo)管外側(cè)端適當(dāng)擴(kuò)大到100 μL移液槍頭可以接入為宜，以100 μL移液器吸取BMP7溶液接入0.1 mm聚乙烯導(dǎo)管注射到脊髓損傷處，術(shù)后連續(xù)7 d進(jìn)行BMP7注射，對(duì)照組大鼠則注射等體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的行為學(xué)檢測(cè)

術(shù)后 6 h、3 d、1、2、4、8 w 采用雙盲法對(duì)各組大鼠進(jìn)行BBB量表評(píng)分，實(shí)驗(yàn)大鼠置于光線充足的試驗(yàn)臺(tái)上，由熟悉BBB評(píng)分方法的非本組實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行觀察評(píng)分，評(píng)分包括大鼠后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)情況、運(yùn)動(dòng)過程中的協(xié)調(diào)狀態(tài)、大鼠后肢爪的的精細(xì)運(yùn)動(dòng)共計(jì)三部分，滿分為21分[5]。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)各組大鼠脊髓損傷節(jié)段NF200及GFAP的表達(dá)量

術(shù)后 6 h、3 d、1、2、4、8 w 分別取 5 只大鼠，腹腔內(nèi)注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，打開胸腔，以冰的4%多聚甲醛灌入大鼠左心室直至大鼠死亡，取背部原切口，以原損傷處為中心上下各0.5 cm處剪斷脊髓組織，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后以切片機(jī)制作厚度為6 μm的組織切片，切片置于60℃烘箱內(nèi)30 min以使蠟融化，二甲苯中脫蠟，酒精梯度脫水，0.3%H2O2甲醛室溫浸泡10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，切片置于0.01 mol/L枸櫞酸溶液中煮沸10 min以修復(fù)抗原，切片冷卻后置于山羊血清封閉液中20 min，孵一抗（抗體稀釋倍數(shù)為1∶200），4℃過夜。切片置于 37℃烘箱中復(fù)溫45 min，PBS沖洗后室溫孵二抗2 h（羊抗鼠 IgG，每張切片滴50 μL），隨后按照DAB顯色試劑盒說明書進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染2 min，1%鹽酸酒精分化10 s，酒精梯度脫水，二甲苯透明，隨后進(jìn)行封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分結(jié)果

對(duì)照組及BMP7實(shí)驗(yàn)組大鼠造模后雙后肢運(yùn)動(dòng)功能完全喪失，1 w后開始逐漸恢復(fù)。在1、2、4、8 w時(shí)BMP7實(shí)驗(yàn)組大鼠BBB評(píng)分均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠BBB評(píng)分表±s，n=5Tab.1 BBB score table at different time points±s，n=5

表1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠BBB評(píng)分表±s，n=5Tab.1 BBB score table at different time points±s，n=5

注：*表示同一時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

分組? 術(shù)前? 6?h? 3?d? 1w? 2w? 4w? 8w?術(shù)后?對(duì)照組?BMP7實(shí)驗(yàn)組?21.00±0.00?21.00±0.00?0.00±0.00?0.00±0.00?0.00±0.00?0.00±0.00?0.33±0.02?0.50±0.05*?3.00±0.19?5.50±0.15*?4.33±0.52?8.00±0.63*?4.41±0.56?8.20±0.34*?

2.2 免疫組化檢測(cè)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)脊髓損傷處NF200及GFAP蛋白表達(dá)結(jié)果

對(duì)照組及BMP7實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓損傷節(jié)段均可見NF200及GFAP陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞（圖1）。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值，結(jié)果表明：BMP7實(shí)驗(yàn)組大鼠NF200陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)術(shù)3 d后逐漸增多，至第4 w時(shí)達(dá)到高峰，且在 1、2、4、8 w時(shí)均大于對(duì)照組；BMP7實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組術(shù)后GFAP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)變化均不明顯，且2組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異不顯著（圖2）。

圖1 免疫組化檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠脊髓損傷節(jié)段NF200及GFAP蛋白表達(dá)結(jié)果（×400）Fig.1 The results of NF200 and GFAP protein expression in spinal cord injury segments in rats at different time points detected by immunohistochemistry(×400)

圖2 免疫組化測(cè)得不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠脊髓損傷處NF200及GFAP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量Fig.2 The number of NF200 and GFAP positive cells in spinal cord injury at different time points detected by immunohistochemistry

3 討論

脊髓損傷的病理過程有2個(gè)階段：原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[6]。原發(fā)性損傷是由外界機(jī)械原因引起的脊柱骨折、椎體滑脫等物理性損傷；繼發(fā)性損傷是局部部位電解質(zhì)失衡、炎癥因子聚集等生物性損傷。繼發(fā)性損傷可造成原發(fā)性損傷未波及到的相鄰脊髓組織髓鞘受損及神經(jīng)細(xì)胞死亡[7]。目前脊髓損傷的手術(shù)治療是以恢復(fù)脊柱的穩(wěn)定性為重心，其對(duì)于已受損神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)無直接促進(jìn)作用，故手術(shù)治療+神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子+干細(xì)胞移植是目前脊髓損傷治療的研究熱點(diǎn)[8]。這一設(shè)想的實(shí)現(xiàn)，關(guān)鍵在于探索出有利于脊髓損傷后神經(jīng)恢復(fù)的營(yíng)養(yǎng)因子。

BMPs隸屬于TGF-β超家族，最早發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)成骨的能力，故命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白，目前越來越多的研究表明其部分成員具有神經(jīng)保護(hù)功能，例如BMP-7在目前的研究中發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷早期據(jù)有抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，促進(jìn)疤痕形成，抑制局部炎癥的作用[9]。胡嵐翔等[10]對(duì)SD大鼠脊髓損傷模型給予BMP7靜脈注射干預(yù)，隨后檢測(cè)到受損脊髓段GFAP表達(dá)量升高，表明BMP7在脊髓損傷后可以促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，促進(jìn)局部膠質(zhì)瘢痕的形成，抑制炎癥的發(fā)生，從而減輕了脊髓損傷后繼發(fā)性損害的程度。因此，本實(shí)驗(yàn)組立項(xiàng)研究BMP7是否具有促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，并進(jìn)一步探索其具體機(jī)制，檢驗(yàn)BMP-7是否為治療脊髓損傷合適的營(yíng)養(yǎng)因子。

本研究利用Allen法制備大鼠急性脊髓損傷模型，在損傷的早期于脊髓損傷處局部注射50 ng BMP7，隨后在不同時(shí)間點(diǎn)以BBB評(píng)分檢測(cè)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，結(jié)果表明BMP7實(shí)驗(yàn)組在1周后BBB評(píng)分高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明脊髓損傷后局部注射BMP7可以促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。這與Sandner等[11]的研究結(jié)果相一致。以免疫組化法檢測(cè)脊髓損傷處神經(jīng)絲蛋白200及神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)情況進(jìn)一步探索BMP7促進(jìn)大鼠脊髓損傷的機(jī)制。神經(jīng)絲蛋白200(neurofilament protein 200，NF200)主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞胞漿及軸突中，其表達(dá)量的高低反映了神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量及其功能狀態(tài)[12]。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白和骨架成分之一，其表達(dá)量的高低可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、壞死等改變的程度[13]。本實(shí)驗(yàn)組以免疫組化法檢測(cè)術(shù)后各組大鼠脊髓損傷局部NF200及GFAP表達(dá)量的變化，結(jié)果表明BMP7組大鼠脊髓損傷處NF200表達(dá)量在3 d后明顯升高，至第4 w時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高并維持在較高水平，而GFAP表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯差異。我們的研究表明了對(duì)脊髓損傷的大鼠局部注射BMP7后脊髓損傷節(jié)段處NF200的表達(dá)量升高而GFAP的表達(dá)量無明顯變化，我們推測(cè)BMP7促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)主要是BMP7具有促進(jìn)脊髓損傷處局部神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化的作用，增加了損傷局部神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)通路的修復(fù)。關(guān)于GFAP表達(dá)量的變化，本研究結(jié)果與胡鳳翔等[10]的結(jié)果不同，他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)BMP7具有促進(jìn)脊髓損傷處GFAP表達(dá)量升高的功能，我們推測(cè)具體原因如下：胡鳳翔[10]等人在試驗(yàn)中使用環(huán)扎法進(jìn)行大鼠脊髓損傷模型的建立，不同的造模方式形成脊髓損傷的具體機(jī)制會(huì)不同，而且他們給予BMP7干預(yù)的方式為靜脈內(nèi)給藥，不同的造模方式及給藥方式使兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果完全不同。

總之，BMP7局部注射可以促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能是BMP7促進(jìn)脊髓損傷局部神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化，從而增加了神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)通路的修復(fù)。這為BMP7在臨床上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為急性脊髓損傷的治療提供了一個(gè)新思路。