腺苷A2a受體在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化中的作用*

陳彥凡, 何以成, 黃卡特, 虞曉明, 陳馬云, 陳 相, 黃曉穎, 王良興

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科； 2. 病理科， 浙江 溫州 325000； 3. 蒼南縣人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 浙江 蒼南 325805)

腺苷(adenosine, Ado)是重要的內(nèi)源性調(diào)控介質(zhì)，具有減少組織損傷和促進(jìn)修復(fù)的作用[1]。Ado受體有4種亞型，即A1R、A2aR、A2bR、A3R。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A2aR具有舒張支氣管、抑制急性肺損傷等效應(yīng)[2]。TGF-β1是最重要的器官纖維化調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，激活的A2aR可以通過抑制TGF-β1表達(dá)而減輕腎間質(zhì)纖維化[3]。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)比研究A2aR基因敲除型小鼠與野生型小鼠在肺間質(zhì)纖維化、TGF-β1表達(dá)方面的差異，以及A2aR特異性激動(dòng)劑能否減輕肺纖維化，探討A2aR在小鼠肺間質(zhì)纖維化形成中的調(diào)控作用及其與TGF-β1的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的復(fù)制和分組

雄性SPF級(jí)野生型BALB/C小鼠30只和雄性SPF級(jí)A2aR基因敲除BALB/C小鼠20只(溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重17～20 g，隨機(jī)分為5組(n=10)。A組：野生型小鼠對(duì)照組；B組：野生型小鼠肺纖維化組；C組：A2aR基因敲除小鼠對(duì)照組；D組：A2aR基因敲除小鼠肺纖維化組；E組：野生小鼠肺纖維化+ CGS21680(A2aR激動(dòng)劑)組。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg體重)麻醉小鼠，常規(guī)消毒，行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，于氣管軟骨環(huán)間隙用5號(hào)針頭穿刺，肺纖維化組小鼠緩慢注入博萊霉素(bleomycin, BLM, 日本化藥株式會(huì)社, 批號(hào)730342) 50 μl(5 mg/kg體重)，對(duì)照組注入等體積生理鹽水，注射后立即將小鼠直立旋轉(zhuǎn)3～5 min，使藥液均勻分布于兩肺，然后縫合皮膚并消毒。小鼠清醒后常規(guī)飼養(yǎng)28 d，A、B、C、D組每天腹腔注射生理鹽水0.5 ml，E組每天腹腔注射CGS21680 0.5 ml(Sigma公司，0.25 mg/kg體重)。

1.2 標(biāo)本取材和指標(biāo)測(cè)定

造模后第29天，眼球后靜脈叢取血處死小鼠。血液置-4 ℃低溫離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，分離血清置-70 ℃低溫冰箱保存待測(cè)。采血后立即打開胸腔，取出肺，沖洗后迅速將右下葉置于4%多聚甲醛液中固定，行病理切片，其余部分置液氮中凍存。每組隨機(jī)選取2只小鼠右下肺組織，行電鏡觀察。

1.3 光鏡、電鏡標(biāo)本制作及膠原纖維的Masson染色

切片常規(guī)脫蠟至水，HE染色，光鏡下觀察。切片Masson染色，顯微鏡下染綠色為膠原沉積陽性，分析肺纖維化程度。取小鼠右肺門處0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm的肺組織，迅速放入2.5%戊二醛固定液中，1%鋨酸后固定1 h，切片，用H-600型透射電鏡觀察。

1.4 肺組織羥脯氨酸、血清TGF-β1含量檢測(cè)

稱取50～100 mg肺組織放入試管中，嚴(yán)格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)要求，測(cè)定羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量；ELISA法(美國(guó)Rapidbio公司)檢測(cè)血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)含量。

1.5 免疫組化法檢測(cè)小鼠肺組織TGF-β1、A2aR的相對(duì)含量

抗小鼠TGF-β1、抗小鼠A2aR單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，兔二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。肺組織切片脫蠟，3%雙氧水處理，滴加血清封閉，加I抗、II抗，DAB顯色，以棕色、棕黃色、褐色為陽性細(xì)胞，采用Image-Proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)觀察分析，以積分光密度(integral optical density，IOD)表示肺組織中各指標(biāo)含量。每只小鼠隨機(jī)選取1張肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，求平均值作為TGF-β1、A2aR的相對(duì)含量。

1.6 原位雜交檢測(cè)小鼠肺組織A2aR mRNA、TGF-β1 mRNA的表達(dá)

1.6.1 寡核苷酸探針 地高辛標(biāo)記的探針購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。探針序列，A2aR：(1)5’-AACAG TAACC TGCAC AACGT CACCA ACTTC TTTGT-3’；(2)5’-TGGAA CAACT GCAGT CAGAA AGACG GGAAC TCCAC-3’；(3)5’-AACTG TTTCA CCTTC TTCTG CTCCA CGTGC CGGCA-3’.TGF-β1: (1)5’-ACCTG CAAGA CCATC GACAT GGAGC TGGTG AAACG-3’；(2)5’-CGTGC AGAGC TGCGC TTGCA GAGAT TAAAA TCGGA-3’；(3)5’-CACAG CTCAC GGCAC CGGAG AGCCC TGGAT ACCAA-3’

1.6.2 雜交過程 切片常規(guī)脫蠟至水，用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶于室溫消化，與地高辛標(biāo)記的A2aR或TGF-β1寡核苷酸探針雜交、封閉。滴加鼠抗地高辛抗體，滴加生物素化過氧化物酶，DAB顯色，陽性結(jié)果呈棕黃色。每只小鼠隨機(jī)選取1張肺組織切片，應(yīng)用Image Pro plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)A2aR mRNA、TGF-β1 mRNA的平均吸光度(Absorbance, A)，隨機(jī)測(cè)定5個(gè)高倍視野，計(jì)算其平均吸光度值作為A2aR mRNA、TGF-β1 mRNA的值。

1.7 Western blot法測(cè)定小鼠肺組織勻漿A2aR、TGF-β1蛋白質(zhì)

取-80 ℃保存的肺組織80～100 mg，加入400 μl RIPA裂解液，置于冰上充分研磨；超聲裂解，離心，取上清液。采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。常規(guī)SDS-PAGE，三明治法恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(300 mA，A2aR、TGF-β1, 50 min)。封閉結(jié)束后加入I抗(抗A2aR抗體濃度為1∶1000，抗TGF-β1抗體濃度為1:500，抗內(nèi)參GAPDH抗體濃度為1∶1000)，4 ℃封閉16 h，分別加入稀釋的羊抗兔IgG(Ⅱ抗)。洗滌后，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光；以Quantity One軟件分析各蛋白質(zhì)的吸光度，計(jì)算各組目的蛋白質(zhì)相對(duì)濃度的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織羥脯氨酸、血清TGF-β1含量的比較

野生型小鼠纖維化組(B組)、A2aR基因敲除小鼠纖維化組(D組)的肺Hyp含量分別高于其各自對(duì)照組(A組、C組，P<0.01)，D組Hyp含量也明顯高于B組(P<0.01)；與B組比較，野生型小鼠纖維化+ CGS21680組(E組) Hyp含量明顯下降(P<0.01)。B組、D組TGF-β1含量分別明顯高于各自對(duì)照組(A組、C組，P<0.01)；D組TGF-β1含量也高于B組(P<0.05)；與B組比較，E組TGF-β1含量明顯下降(P<0.01)。TGF-β1與肺Hyp含量之間呈線性相關(guān)(偏相關(guān)系數(shù)r=0.773，P<0.05，表1)。

GroupHyp (μg/g)TGF-β1(μg/ml)A465.89±22.74195.13±37.87B606.43±58.55**353.42±33.11**C490.54±43.03214.73±32.47D689.56±97.99##▲▲406.18±50.81#▲▲E502.90±58.42##218.54±33.87##

Hyp: Hydroxyproline; TGF-β1: Transforming growth factor-β1

**P<0.01vsA group;#P<0.05，##P<0.01vsB group;▲▲P<0.01vsC group

2.2 各組小鼠肺臟大體及顯微結(jié)構(gòu)的比較

A組、C組肺臟大體標(biāo)本表面光滑，彈性好，色澤紅潤(rùn)。B組、D組的肺臟彈性差，呈灰色，表面不光滑，甚至有疤痕樣增生；E組的上述表現(xiàn)較B組和D組明顯減輕(圖1，見彩圖頁(yè)Ⅰ)。

光鏡下，A組和C組肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡壁薄，肺泡間隔無明顯增寬及出血。B組肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂破壞，肺泡腔狹窄或部分陷閉，肺泡間隔增寬，纖維增生明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；D組的上述表現(xiàn)較B組、C組明顯加重；E組上述表現(xiàn)較B組明顯減輕(圖2，見彩圖頁(yè)Ⅰ)。

2.3 各組小鼠肺臟組織超微結(jié)構(gòu)及纖維組織Masson染色

A組和C組肺組織I型、II型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體及板層小體無改變，肺泡間隔無明顯增寬，無膠原纖維增生；B組I型、II型肺泡上皮細(xì)胞明顯空泡化，肺泡隔擴(kuò)大，可見膠原纖維增生，炎細(xì)胞增多，板層小體空泡化，細(xì)胞核輕微固縮。D組肺組織的上述表現(xiàn)較B組愈加明顯。E組的上述表現(xiàn)明顯減輕(圖3)。A組、C組肺泡間隔的陽性區(qū)域較少，呈細(xì)絲狀，散在分布；B組、D組的陽性區(qū)域明顯增大，呈融合片狀分布，其中D組更加明顯；E組的上述表現(xiàn)較B、D組明顯減輕(圖4，見彩圖頁(yè)Ⅱ)。

Fig.3Changes of ultrastructure in lung tissue of mice

A: WT control group; B: WT fibrosis group; C: A2aR KO control group, D: A2aR KO fibrosis group; E: WT fibrosis+A2aR agonist (CGS21680) group; WT: Wild type mice; A2aR KO:A2aR gene knockout

2.4 各組小鼠肺組織A2aR蛋白質(zhì)和A2aR mRNA表達(dá)的比較

免疫組化法檢測(cè)結(jié)果表明，B組小鼠肺組織A2aR蛋白質(zhì)表達(dá)明顯高于A組(P<0.01，表2)；E組肺組織A2aR蛋白質(zhì)表達(dá)明顯高于B組(P<0.01)。Western blot方法檢測(cè)結(jié)果表明，B組肺組織A2aR蛋白質(zhì)含量高于A組(P<0.05)，E組肺組織A2aR蛋白質(zhì)含量高于B組(P<0.01)。原位雜交檢測(cè)結(jié)果表明，B組肺組織A2aR mRNA的表達(dá)高于A組(P<0.01)，E組肺組織A2aR mRNA表達(dá)明顯高于B組(P<0.01，圖5,6,7，圖5見彩圖頁(yè)Ⅱ，圖6見彩圖頁(yè)Ⅲ)。

GroupA2aR(immunohistochemical)(IOD)A2aR Western-blot(relative value)A2aR mRNA(OD)A32.01±8.150.220±0.10235.34±5.02B53.04±6.72**0.521±0.079*56.87±15.12**E69.20±14.99##1.211±0.354##76.65±7.34##

*P<0.05，**P<0.01vsA group;##P<0.01vsB group

Fig.7Expression of A2aR protein in mice(Western blot)

A: WT control group; B: WT fibrosis group; C: A2aR KO control group; D: A2aR KO fibrosis group; E: WT fibrosis+A2aR agonist (CGS21680) group; WT: Wild type mice; A2aR KO: A2aR gene knockout

2.5 各組小鼠肺臟TGF-β1蛋白質(zhì)含量、TGF-β1 mRNA表達(dá)的比較

免疫組化結(jié)果顯示，B組、D組肺組織TGF-β1蛋白質(zhì)含量分別明顯高于A組、C組(P<0.01)；D組也高于B組(P<0.05)；E組與B組比較，則明顯下降(P<0.01，表3，圖8，見彩圖頁(yè)Ⅲ)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明：B組、D組肺組織TGF-β1蛋白質(zhì)含量分別高于A組、C組(P<0.01)，D組也高于B組(P<0.05)；與B組比較，E組則明顯下降(P<0.05，表3，圖9)。原位雜交檢測(cè)結(jié)果表明，B組、D組肺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)分別明顯高于A組、C組(P<0.01)，D組也高于B組(P<0.01)；與B組比較，E組則明顯下降(P<0.01，表3，圖10，見彩圖頁(yè)Ⅳ)。

GroupTGF-β1(immunohistochemical)(IOD)TGF-β1(Western-blot)(relative value)TGF-β1mRNA(IOD)A62.12±7.960.517±0.27753.12±6.89B74.53±8.45**2.256±0.430**68.35±7.54**C54.71±6.200.767±0.50148.76±6.45D79.25±6.70#▲▲4.040±1.708#▲▲80.33±7.90##▲▲E55.07±7.29##1.040±0.442#49.08±8.14##

TGF-β1： Transforming growth factor-β1

**P<0.01vsA group;#P<0.05，##P<0.01vsB group;▲▲P<0.01vsC group

Fig.9Expression of TGF-1β protein in mice(Western blot)

A: WT control group; B: WT fibrosis group; C: A2aR KO control group; D: A2aR KO fibrosis group; E: WT fibrosis+A2aR agonist (CGS21680) group; WT: Wild type mice; A2aR KO: A2aR gene knockout

3 討論

博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化是目前被廣泛接受的動(dòng)物模型[4]。研究表明，肺纖維化小鼠肺組織早期以炎性反應(yīng)為主，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等大量聚集，隨著炎性反應(yīng)減弱，促纖基因的表達(dá)升高，膠原合成增加[5]。本實(shí)驗(yàn)于光鏡下可見野生型纖維化小鼠肺組織中肺泡壁增厚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂破壞，肺泡腔狹窄或部分陷閉，纖維增生明顯，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；而A2aR基因敲除肺纖維化小鼠肺組織中上述表現(xiàn)更為明顯。同時(shí)，Masson染色后，A2aR基因敲除肺纖維化小鼠肺泡間隔陽性區(qū)域呈融合片狀分布，其面積較野生型肺纖維化小鼠明顯增大。電鏡下，野生型纖維化小鼠肺組織中I型、II型肺泡上皮細(xì)胞和板層小體明顯空泡化，細(xì)胞核固縮；A2aR基因敲除肺纖維化小鼠的細(xì)胞凋亡更為顯著，提示A2aR基因的缺失加重了小鼠肺纖維化的形成[6]。

羥脯氨酸(Hyp)是膠原代謝的重要指標(biāo)，肺組織中Hyp的含量可間接判斷肺纖維化的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野生型纖維化小鼠和A2aR基因敲除肺纖維化小鼠肺組織Hyp含量明顯高于各自對(duì)照組(P<0.01)，提示BLM明顯促進(jìn)肺泡外基質(zhì)的增生和沉積，繼而形成肺纖維化[7]。而A2aR基因敲除肺纖維化小鼠的Hyp的含量較野生型肺纖維化小鼠愈加增高。TGF-β1是一類來源于單核巨噬細(xì)胞具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的多肽，現(xiàn)已被認(rèn)為是肺纖維化形成及發(fā)展的關(guān)鍵因子[8]，TGF-β1與成纖維細(xì)胞表面受體結(jié)合，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的分裂、增殖及趨化，產(chǎn)生膠原并抑制其降解，促進(jìn)組織纖維增生及修復(fù)。在慢性阻塞性肺病、肺結(jié)核、矽肺和彌漫性間質(zhì)性肺疾病等肺纖維化過程中，TGF-β1水平均明顯升高。本研究顯示，纖維化組小鼠的血清TGF-β1濃度高于各自對(duì)照組。免疫組化和Western blot兩種不同方法檢測(cè)均顯示，纖維化組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白質(zhì)含量明顯高于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，TGF-β1 mRNA的表達(dá)也明顯增加(P<0.01)，提示TGF-β1參與了BLM誘導(dǎo)的肺纖維化的形成[9]。A2aR基因敲除肺纖維化小鼠的上述指標(biāo)均明顯高于野生型肺纖維化小鼠，且與A2aR基因敲除纖維化組小鼠肺纖維化程度增加相一致，提示A2aR缺失可能促進(jìn)了TGF-β1的合成和分泌，從而增加了膠原的沉積[10]。

正常狀態(tài)下，細(xì)胞外腺苷(Ado)濃度較低，但在炎癥或損傷應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)Ado成倍增多并分泌至細(xì)胞外，調(diào)節(jié)免疫和炎癥損傷。目前認(rèn)為，Ado與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等表面的A2aR結(jié)合而發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能[11]。研究發(fā)現(xiàn)，A2aR在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝纖維化、過敏原或煙草誘導(dǎo)的肺部炎癥以及急性肺損傷中均有反應(yīng)性表達(dá)增強(qiáng)[12]。本研究采用Western blot、免疫組化和原位雜交等方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示野生型纖維化小鼠肺組織中A2aR蛋白質(zhì)及A2aR mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)，顯示在BLM誘導(dǎo)下，肺組織A2aR表達(dá)呈反應(yīng)性增強(qiáng)。Ohta等[13]發(fā)現(xiàn)，A2aR基因敲除小鼠的炎癥反應(yīng)較野生型小鼠明顯加重，甚至導(dǎo)致死亡，應(yīng)用A2aR激動(dòng)劑CGS21680能明顯抑制TNFα等炎性介質(zhì)的表達(dá)和釋放。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用A2aR激動(dòng)劑CGS21680干預(yù)后，肺組織纖維化程度明顯減輕，膠原沉積減少，Hyp含量降低，肺泡上皮細(xì)胞損傷減輕，同時(shí)血清中TGF-β1濃度、肺組織TGF-β1蛋白質(zhì)含量及TGF-β1 mRNA的表達(dá)也明顯低于野生型纖維化小鼠，提示在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化中，A2aR通過降低TGF-β1的表達(dá)而抑制纖維化的形成[14]。但A2aR調(diào)節(jié)TGF-β1表達(dá)的具體信號(hào)途徑尚未闡明，有待進(jìn)一步研究。