白扁豆多糖對人胃癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制*

張艷姿， 柯瑞君， 蔣盼若， 楊林軍， 陳佳玉

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 浙江溫州 325035; 2. 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江紹興312000; 3. 臺州市立醫(yī)院，浙江臺州318000; 4. 臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江臺州318000)

胃癌是世界常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居我國惡性腫瘤第2位[1]。目前，手術(shù)切除仍是治療胃癌的最佳方法。但臨床上由于缺乏早期胃癌特異性診斷指標(biāo)、胃癌早期患者臨床癥狀不明顯等原因，很多胃癌患者確診時已達(dá)到胃癌進(jìn)展期甚至是晚期[2]，其術(shù)后5年生存率不足20%[3]。因此，尋找對胃癌有治療效果、毒副作用小的藥物一直是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

白扁豆具有抗菌、抗病毒、提高細(xì)胞免疫功能的作用[4]。近年來，越來越多的研究證實(shí)，多糖在提高人體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化及降血糖等過程中起著重要作用[5-7]，但白扁豆中的多糖對胃癌的作用及其作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。本文擬探討白扁豆多糖誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制，以期為白扁豆多糖用于胃癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞周期檢測試劑盒(凱基生物，江蘇)；Cell Titer96 Aqueous Non-radioactive Cell proliferation Assay (MTS, Promega)；Annexin V-PE/7-AAD apoptosis assays kit (BD)；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(天晶公司，上海)；RPMI 1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco)；TrizolReagent、SuperScriptIII First-Strand Synthesis System(Invitrogen)；Hoechst 33342染色液 (Solarbio，上海)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。白扁豆多糖為本實(shí)驗(yàn)室從藥用白扁豆提取的多糖[8]，純度為92%。人胃癌細(xì)胞株HGC-27和SGC-7901均購自ATCC細(xì)胞庫；引物由上海生工合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及MTS法檢測細(xì)胞增殖活性的抑制率

取對數(shù)生長期的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞，胰酶液消化后，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的密度調(diào)整為5×103cells/ml，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，200 μl/孔，各設(shè)3個復(fù)孔。將細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別用不同濃度的白扁豆多糖(終濃度為16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0 μg/ml)作用于該細(xì)胞，每個藥物濃度設(shè)3個復(fù)孔。加藥后24 h、48 h和72 h時，分別向各培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μl MTS溶液，再將其放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h。用酶標(biāo)儀檢測490nm處吸光度(A490nm值)，按下式計(jì)算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率：抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組平均A490nm值/對照組平均A490nm值)]×100%。

1.3 JC-1法檢測細(xì)胞膜電位

取細(xì)胞懸液，調(diào)整其最終密度為1×104cells/ml，接種到6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，分別換成含0 μg/ml、4 μg/ml白扁豆多糖的完全培養(yǎng)液，各設(shè)3個復(fù)孔，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液和1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。棄上清液，用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次。每孔加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，置熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞，胰酶液消化后，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液將HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的密度調(diào)整為5×104cells/ml，接種到6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到90%，將培養(yǎng)基換成含有0 μg/ml、4 μg/ml白扁豆多糖的完全培養(yǎng)液，各設(shè)3個復(fù)孔，于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，用不含EDTA的胰酶液消化6孔板內(nèi)的細(xì)胞，500×g離心5 min收集細(xì)胞，以4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后于4 ℃、500×g離心5 min，棄上清。每孔加入250 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml；取100 μl細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，同時加入5 μl Annexin V/PE和5 μl 7-AAD，輕輕混勻。避光、室溫下反應(yīng)15 min，加入400 μl 1×Binding Buffer，充分混勻，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

胰酶液消化后回收的上述經(jīng)0 μg/ml或4 μg/ml白扁豆多糖作用24 h的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后于4 ℃、600×g離心5 min回收細(xì)胞。每組取5×106個細(xì)胞，分別加入1 ml冰浴預(yù)冷的70% 乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃條件下固定2 h。4 ℃、600×g離心5min，棄上清，用4℃預(yù)冷的PBS于同樣條件下離心洗滌細(xì)胞2次。向細(xì)胞沉淀中加入100 μl RNase A，37 ℃水浴孵育30 min，加入400 μl PI染色液，混勻，置于4 ℃避光作用30 min，流式細(xì)胞儀于激發(fā)波長488 nm下檢測。

1.6 QPCR法檢測細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平

分別取上述經(jīng)0 μg/ml或4 μg/ml白扁豆多糖作用24 h的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞，完全棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次；按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)Nanodrop儀器定量。取5 μg RNA樣品，用SuperScriptIII First-Strand Synthesis System逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，QPCR法進(jìn)行Bax、Bcl-2和caspase-3基因表達(dá)水平的檢測，試劑用量參照說明書，引物序列見表1。

Tab.1The primer sequence

Gene nameForward primerReverse primerBcl-2 geneGGGTGGGAGGGAG-GAAGAATTTCGCAGAGGCATCA-CATCGBax geneCTCACCGCCTCACT-CACCATTGTGTCCCGAAGGAG-GTTTATTCaspase-3 geneGAGTAGATGGTTT-GAGCCTGAGTGCCTCACCACCTT-TAGAACGAPDH geneTGAAGGTCGGAGT-CAACGGCTGGAAGATGGTGATGG-GATT

2 結(jié)果

2.1 MTS法檢測細(xì)胞增殖活性

MTS法檢測結(jié)果(表2)顯示，胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901經(jīng)濃度為16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml白扁豆多糖作用24 h、48 h和72 h后，其增殖活性受到不同程度的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其受抑制程度與藥物濃度和作用時間有關(guān)。當(dāng)白扁豆多糖濃度為4 μg/ml、作用時間為24 h時，胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901的細(xì)胞增殖抑制率分別為(52.12±2.27)%和(43.47±2.34)%，與0 μg/ml白扁豆多糖組差異顯著(P<0.01)，因此選擇此濃度和作用時間進(jìn)行后續(xù)白扁豆多糖作用的機(jī)制研究。

WLP(μg/ml)HCG-27SGC-790124 h48 h72 h24 h48 h72 h0000000110.03±0.9821.12±3.22*37.24±3.41**9.42±1.1717.67±2.84*25.71±2.66*225.17±1.19*38.22±5.17**48.15±6.15**21.22±2.04*31.17±5.19**49.38±5.27**452.12±2.27**61.19±5.33**71.01±5.44**43.47±2.34**56.52±4.68**73.43±6.22**869.28±6.46**78.58±4.62**89.34±2.01**54.41±5.49**61.22±7.14**80.42±7.64**1678.27±5.31**87.31±3.16**92.62±2.40**59.97±6.74**89.52±8.45**94.18±6.32**

*P<0.05,**P<0.01vsthe group treated with 0 μg/ml white lentil polysaccharides(WLP)

2.2 白扁豆多糖對細(xì)胞線粒體膜電位的影響

熒光倒置顯微鏡檢測結(jié)果(圖1)顯示，胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖作用24 h后，細(xì)胞線粒體膜電位明顯下調(diào)。

Fig.1Effect of white lentil polysaccharides on mitochondrial membrane potential of gastric cancer cell lines HGC-27 and SGC-7901(40 ×)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

結(jié)果如圖2所示，經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖處理后，HGC-27和SGC-7901細(xì)胞凋亡率分別為53.15%和38.77%，較PBS處理組(8.07%和6.03%)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，4 μg/ml白扁豆多糖能誘導(dǎo)HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的凋亡。

Fig.2The inducing apoptosis effect of white lentil polysaccharides on gastric cancer cell lines examined by a flow cytometery(n=3)

*P<0.01vsthe group treated with 0 μg/ml white lentil polysaccharides

2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

結(jié)果如圖3所示，與未用藥處理組比較，經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖處理后，處于G1、S、G2期的HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的比例無明顯變化。因此，4 μg/ml白扁豆多糖對HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯影響(P>0.05)。

Fig.3Effect of white lentil polysaccharides on the cell cycle of gastric cancer cell lines HGC-27 and SGC-7901(n=3)

2.5 QPCR檢測結(jié)果

QPCR檢測結(jié)果(圖4)證實(shí)，與未用藥處理組比較，經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖作用24 h后，胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901的凋亡相關(guān)蛋白Bax和caspase-3基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，而Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)(P<0.01)。

*P<0.01vsthe group treated with 0 μg/ml white lentil polysaccharides

3 討論

細(xì)胞凋亡是由多種基因控制的細(xì)胞程序性死亡，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)。它控制著細(xì)胞生長與分化的方向，當(dāng)細(xì)胞凋亡受抑制時，便可以引起包括胃癌在內(nèi)的一系列腫瘤的發(fā)生。胃癌嚴(yán)重威脅人類健康。因此，探索促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的新藥物并揭示其作用機(jī)制一直是胃癌治療研究的熱點(diǎn)和靶點(diǎn)。

近年來，越來越多的研究證實(shí)，多糖在提高機(jī)體免疫功能、抗腫瘤等過程中起著重要作用[4]，如枸杞多糖可以誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞的凋亡[9]、(1→3)-β-D-葡聚糖連接的香菇多糖對S180荷瘤小鼠的腫瘤也有較高的抑制作用[5]。但目前有關(guān)白扁豆多糖抗胃癌的作用研究尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度的白扁豆多糖作用后，胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901的細(xì)胞凋亡率明顯增加，細(xì)胞增殖活性均受到不同程度的抑制，且其受抑制程度與藥物作用的濃度和時間有關(guān)。用藥前后HGC-27和SGC-7901的細(xì)胞周期無明顯變化。因此，白扁豆多糖可通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡來發(fā)揮抗胃癌作用。

為了揭示白扁豆多糖誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，本研究進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因mRNA水平分析和細(xì)胞膜電位觀察。結(jié)果證實(shí)，經(jīng)4 μg/ml白扁豆多糖作用后，胃癌細(xì)胞HGC-27和SGC-7901的線粒體膜電位明顯降低，細(xì)胞內(nèi)Bax、caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，而Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平卻較未用藥組明顯下降。Bcl-2蛋白家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Bax和Bcl-2是該家族中最具代表性的蛋白質(zhì)[10,11]。在細(xì)胞正常生長和分化過程中，Bax為Bcl-2活性的主要調(diào)控因子[12]，它與Bcl-2的表達(dá)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)藥物作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Bax基因表達(dá)增多時，Bax不僅可以直接與細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2形成異二聚體，發(fā)揮其抑制Bcl-2的抑凋亡作用，而且還可以移位到細(xì)胞線粒體上[13]，導(dǎo)致線粒體膜通透性增高，細(xì)胞膜電位下降，激活細(xì)胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶caspase-3[14]，進(jìn)而引起細(xì)胞廣泛的損傷和變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。因此，白扁豆多糖可以通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2和caspase-3基因的表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

白扁豆是一種常用中藥，我國很多地區(qū)都有栽培，資源十分豐富。其營養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉。此外白扁豆多糖對正常細(xì)胞無明顯的毒副作用[16]。因此，將白扁豆多糖作為抗腫瘤藥物成分進(jìn)行開發(fā)有較好的應(yīng)用前景。本研究為白扁豆多糖的進(jìn)一步臨床用藥研究奠定了基礎(chǔ)。