納米炭黑顆粒復(fù)合寒冷暴露對(duì)小鼠肺部氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響*

趙丹丹， 郭 展， 李 曦， 張永強(qiáng)， 張 莉， 朱五福， 鄭鵬武△， 楊丹鳳△

(1. 江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330013； 2. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所， 天津 30050)

近年來(lái)，隨著灰霾、霧霾天氣的普遍發(fā)生，空氣污染尤為嚴(yán)重。2013年10月，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將室外大氣污染列為人類(lèi)致癌物之一[1]。大氣顆粒物是空氣環(huán)境中化學(xué)成分最復(fù)雜、人群危害最嚴(yán)重的污染物之一。按空氣動(dòng)力學(xué)直徑，可將顆粒物劃分為：可吸入顆粒物(PM10，空氣動(dòng)力學(xué)直徑<10 μm)、細(xì)顆粒物(PM2.5，空氣動(dòng)力學(xué)直徑<2.5 μm)和超細(xì)顆粒物(ultrafine particles, UFPs，空氣動(dòng)力學(xué)直徑<0.1 μm)，其中超細(xì)顆粒物所占總顆粒數(shù)的比率可達(dá)到92%[2]。流行病學(xué)調(diào)查和毒理學(xué)研究顯示，顆粒越小毒性越大，尤其是UFPs。近年來(lái)，在輪胎、橡膠產(chǎn)品、非橡膠產(chǎn)品以及顏料和油墨的生產(chǎn)、制作等多個(gè)領(lǐng)域納米炭黑顆粒的應(yīng)用逐漸增多，使得人們?cè)谘芯俊⑸a(chǎn)、消費(fèi)和環(huán)境中接觸納米炭黑顆粒的機(jī)會(huì)也迅速增多。研究表明，納米炭黑顆粒能引發(fā)體內(nèi)外系統(tǒng)中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[3,4]。采用經(jīng)鼻吸入或者氣管滴注方式暴露于納米炭黑顆粒均可導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物肺部發(fā)生炎癥反應(yīng)[5]，在小鼠肺部可觀察到劑量依賴(lài)性或時(shí)間依賴(lài)性的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，加劇ROS的形成[6]。與此同時(shí)，近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，低溫刺激和冷空氣活動(dòng)可使呼吸系統(tǒng)疾病，如上呼吸道感染、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、慢性支氣管炎、肺炎、哮喘等的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[7]。鑒于我國(guó)近幾年冬季霧霾天氣尤為嚴(yán)重，機(jī)體面臨超細(xì)顆粒物及寒冷暴露的雙重負(fù)荷刺激，本研究在Husain等[8]人的研究基礎(chǔ)上，選擇0.45 mg/ml及4.05 mg/ml納米炭黑顆粒懸液作為染毒濃度，4 ℃作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)冷暴露溫度，擬通過(guò)建立納米炭黑顆粒復(fù)合寒冷暴露動(dòng)物模型，探討二者協(xié)同對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激水平的影響，為寒冷環(huán)境下納米級(jí)炭黑顆粒危害性評(píng)價(jià)提供毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，納米炭黑顆粒購(gòu)自北京德科島金科技有限公司，AJY220電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，CNL-24多樣品組織研磨機(jī)(天津市科萊恩實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司)，TGL-6臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

納米炭黑顆粒染毒液的制備：用生理鹽水緩慢沖洗正常小鼠肺部,采集到的肺泡灌洗液于4 ℃、1 500 r/min離心15 min，取上清配制含10%無(wú)細(xì)胞肺泡灌洗液的生理鹽水液，用作納米炭黑顆粒的分散液。準(zhǔn)確稱(chēng)取18 mg納米炭黑顆粒，加入4 ml配制好的分散液后密封，置漩渦振蕩混勻器上初步振蕩混勻，再超聲振蕩2 h，配制成4.05 mg/ml的高劑量納米炭黑顆粒染毒液，稀釋9倍制成0.45 mg/ml低劑量染毒液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和染毒方法

72只健康SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體重(18±2) g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度為(20±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，自然光照，普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)期間小鼠可自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)一周后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組：對(duì)照(Ctrl)組、冷暴露(C)組、低劑量染毒(L)組、低劑量染毒復(fù)合冷暴露(LC)組、高劑量染毒(H)組、高劑量染毒復(fù)合冷暴露(HC)組，每組12只。采用吸入式氣管滴注方式進(jìn)行一次性染毒。Ctrl和C組小鼠各滴注含納米炭黑顆粒分散液40 μl，L和LC組小鼠各滴入濃度為0.45 mg/ml的染毒液40 μl，H和HC組小鼠各滴入濃度為4.05 mg/ml的染毒液40 μl。將所有冷暴露處理組小鼠兩只一籠置于4 ℃進(jìn)行4 h/d的冷暴露處理，共20 d。冷暴露期間所有小鼠禁食禁水。定期稱(chēng)取小鼠體重并記錄。

1.3 小鼠肺重量及其臟器指數(shù)的測(cè)定

冷暴露結(jié)束24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠。小鼠稱(chēng)重后，打開(kāi)胸腔取出全肺，用冷生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干后稱(chēng)全肺濕重，以全肺濕重占小鼠體重之比計(jì)算小鼠肺臟器指數(shù)。

1.4 小鼠肺氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

取肺組織，按1：9 (g/ml)比例加入PBS制成10%的組織勻漿，以3 500 r/min離心20 min，取上清分裝于離心管中，置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用相關(guān)試劑盒測(cè)定SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量。

1.5 小鼠肺組織學(xué)觀察

取3只小鼠肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛液固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色、脫水透明。制片后于光鏡下觀察組織病理改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 納米炭黑顆粒表征

在透射電鏡下對(duì)納米炭黑顆粒進(jìn)行表征，結(jié)果見(jiàn)圖1。TEM檢測(cè)結(jié)果表明：炭黑顆粒大體呈葡萄球狀，分散性較好，顆粒直徑為30～50 nm。

2.2 小鼠體重變化

在動(dòng)物建模過(guò)程中，各組小鼠行為活動(dòng)無(wú)異常，飼料和水的消耗量無(wú)明顯差異。小鼠體重變化情況(表1)表明：?jiǎn)渭兝浔┞督M與納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組的小鼠體重均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，單純冷暴露組和納米炭黑顆粒染毒復(fù)合寒冷雙重暴露組小鼠體重均顯著低于單純?nèi)径窘M(P<0.05)，但低劑量染毒復(fù)合冷暴露和高劑量染毒復(fù)合冷暴露組之間無(wú)顯著差異；對(duì)照組和單純?nèi)径窘M小鼠體重在染毒14 d后顯著升高(P<0.05)，單純冷暴露組與納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組小鼠體重在冷暴露開(kāi)始后顯著減少(P<0.05)，在染毒14 d后小鼠體重均無(wú)顯著變化。兩因素方差分析顯示，冷暴露對(duì)小鼠體重變化產(chǎn)生主效應(yīng)，納米炭黑顆粒物染毒與冷暴露復(fù)合對(duì)小鼠體重變化無(wú)交互作用。

Fig.1Characterization of Nanoscale Carbon Black Particles by TEM

Tab. 1 Effects of Nano-carbon black particles combined with cold exposure on the body weight of n=10)

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

*P<0.05，**P<0.01vsCtrl at the same day；#P<0.05vsthe same group on 0 day；△P<0.05，△△P<0.01vsL group at the same day;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsH group at the same day

2.3 小鼠肺臟器指數(shù)的變化

納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組小鼠肺組織重量及肺指數(shù)的變化見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，各組肺組織重量及其肺指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.4 肺組織病理學(xué)改變

納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組小鼠肺部組織病理學(xué)改變見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，對(duì)照組與單純冷暴露組小鼠肺泡壁均顯示增厚并有輕微充血現(xiàn)象(圖2A、2B)；單純?nèi)径窘M及復(fù)合冷暴露的染毒組，肺支氣管腔和肺泡腔內(nèi)均可見(jiàn)散在的黑色顆粒沉積(圖2C、2D、2E、2F)；高劑量染毒組可見(jiàn)肺泡壁明顯增厚，血管內(nèi)有充血現(xiàn)象，部分區(qū)域發(fā)生實(shí)變(圖2E)；高劑量染毒復(fù)合冷暴露組可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破環(huán)，排列比較凌亂，有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)充血明顯(圖2F)。

GroupMass of lung(g)Index of lung(%)Ctrl0.13±0.020.72±0.07 C0.13±0.010.73±0.08L0.13±0.010.71±0.04LC0.13±0.010.73±0.06H0.13±0.020.67±0.04HC0.13±0.020.70±0.06

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

Fig.2Morphological characteristics of lung by H&E staining(HE×200)

A: Control group; B: Cold exposure group; C: Low dose group; D: Low dose combined with cold exposure group; E: High dose group; F: High dose combined with cold exposure group

2.5 小鼠肺部氧化應(yīng)激指標(biāo)水平

納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露處理小鼠肺部氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化(表3)表明：?jiǎn)渭兝浔┞督M、單純?nèi)径窘M及染毒復(fù)合冷暴露組的SOD活力均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；染毒復(fù)合冷暴露組的T-SOD活力有低于單純?nèi)径窘M的趨勢(shì)，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；單純低劑量染毒和單純高劑量染毒組間差異不顯著(P<0.05)。單純高劑量染毒組及高劑量染毒復(fù)合冷暴露組GSH-Px活力顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且高劑量染毒組GSH-Px活力顯著低于低劑量染毒組(P<0.01)；高劑量染毒復(fù)合冷暴露組GSH-Px活力顯著低于低劑量染毒復(fù)合冷暴露組(P<0.05)；單純?nèi)径窘M與復(fù)合冷暴露的染毒組之間均無(wú)明顯差異(P<0.05)。高劑量染毒組及染毒復(fù)合冷暴露組的MDA含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組MDA含量顯著高于單純冷暴露組(P<0.05)，有稍高于單純?nèi)径窘M的趨勢(shì)，差異無(wú)顯著性(P<0.05)；單純?nèi)径窘M之間及染毒復(fù)合冷暴露組之間差異不顯著(P<0.05)。兩因素方差分析顯示，冷暴露后肺組織SOD活力顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；隨著染毒劑量的增加，GSH-Px活力逐漸降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；冷暴露與納米炭黑顆粒物對(duì)SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響無(wú)交互作用。

GroupSOD(U/mg Pro)GSH-Px(U/mg Pro)MDA(nmol/mg Pro)Ctrl70.53±9.371670.29±278.491.83±0.33C56.98±14.28*1551.48±188.042.26±0.60L57.93±8.05*1561.62±273.932.44±0.69LC51.99±9.26*1499.91±191.582.99±0.99*▲ H56.65±6.15*1273.26±228.64**##2.67±0.46**HC50.57±4.51*1206.39±157.51**△3.28±0.69**▲▲

Ctrl: Control group; C: Cold exposure group; L: Low dose group; LC: Low dose combined with cold exposure group; H: High dose group; HC: High dose combined with cold exposure group

*P<0.05，**P<0.01vsCtrl group;##P<0.01vsL group;△P<0.05vsLC group;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsC group

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)發(fā)生灰霾天氣的地區(qū)和次數(shù)呈突發(fā)上升趨勢(shì)，給人們的生產(chǎn)、生活和健康帶來(lái)巨大的危害，而超細(xì)顆粒物(UFPs)是灰霾的主要組成成分之一。超細(xì)顆粒物又稱(chēng)納米顆粒物。UFPs的自然來(lái)源主要為生物燃燒，包括可控和不可控的森林火災(zāi)、草原火災(zāi)等；人為污染主要包括化石燃料的燃燒及汽車(chē)尾氣的排放等。由于納米顆粒具有小尺寸效應(yīng)和高反應(yīng)性，納米顆?？梢圆唤?jīng)過(guò)復(fù)雜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程而直接穿透組織屏障或細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，甚至細(xì)胞器中，引起細(xì)胞調(diào)亡、DNA損傷、炎癥反應(yīng)等[9,10]，從而增加顆粒物的潛在毒性，與大直徑顆粒相比具有更大的健康危害效應(yīng)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，呼吸系統(tǒng)是納米級(jí)炭黑顆粒暴露最直接的作用靶點(diǎn)，當(dāng)顆粒物進(jìn)入肺組織后，顆粒物粒徑的大小可以影響其在肺內(nèi)的沉積部位，相對(duì)于微米級(jí)顆粒，納米級(jí)炭黑顆粒毒性更強(qiáng)，更容易引起炎癥反應(yīng)[12]。而且納米顆粒引起的活性氧簇(ROS)的生成量與其對(duì)肺部的促炎癥效應(yīng)有直接關(guān)系，過(guò)量ROS的產(chǎn)生可直接或間接誘導(dǎo)脂類(lèi)、蛋白質(zhì)及DNA分子結(jié)構(gòu)和功能改變，導(dǎo)致組織損傷[13]。研究發(fā)現(xiàn)，低溫刺激或冷空氣活動(dòng)可以改變生物體的氧化與抗氧化間的平衡，通過(guò)黃嘌呤氧化酶活性增高、髓過(guò)氧化物酶活性降低使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的自由基，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，誘發(fā)氧化損傷[14]。由此可見(jiàn)，納米顆粒及低溫刺激均會(huì)對(duì)機(jī)體造成不良影響。因此，本研究結(jié)合冬季霧霾天氣尤為嚴(yán)重的這一現(xiàn)狀，通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行不同劑量納米炭黑顆粒染毒與寒冷暴露的復(fù)合刺激，探討4 ℃刺激下納米炭黑顆粒染毒所致肺組織的氧化損傷情況。

研究結(jié)果表明，單純冷暴露組和染毒復(fù)合冷暴露組小鼠體重均明顯降低，炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組體重均顯著低于單純的染毒組，說(shuō)明冷暴露及納米炭黑顆粒物對(duì)小鼠的整體能量代謝均產(chǎn)生了不同程度的影響，且冷暴露與納米炭黑顆粒的雙重暴露對(duì)小鼠整體能量代謝的影響更加嚴(yán)重。

小鼠肺部病理檢測(cè)顯示，單純?nèi)径窘M及染毒復(fù)合冷暴露組小鼠肺泡腔內(nèi)有黑色顆粒沉積；隨著染毒物濃度的增加，支氣管腔、肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)較多黑色顆粒沉積，肺組織纖毛破壞、肺泡壁結(jié)構(gòu)紊亂、肺間隔增厚等變化更加明顯。在染毒低、高濃度組均可見(jiàn)程度不一的充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，復(fù)合冷暴露后肺泡腔內(nèi)出血更加嚴(yán)重。這表明納米炭黑顆粒復(fù)合冷暴露對(duì)肺組織的破壞更嚴(yán)重。

在生理狀態(tài)下，ROS作為中間體產(chǎn)生，受到各種解毒酶(如SOD、GSH-Px、CAT)及各種抗氧化劑(如維生素E和谷胱甘肽)的影響，這些抗氧化酶和抗氧化劑在機(jī)體清除自由基、防止各種病理變化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[15]。研究表明，機(jī)體受到氧化損傷時(shí)，可導(dǎo)致過(guò)氧化產(chǎn)物增多進(jìn)而使組織內(nèi)SOD含量降低[16]。龍杰等發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激使機(jī)體SOD活力顯著下降，MDA含量顯著升高[17]；羅斌等發(fā)現(xiàn)，低溫刺激可引起機(jī)體SOD活力顯著下降[18]。本實(shí)驗(yàn)中，單純冷暴露組、單純?nèi)径窘M及納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露組小鼠肺部的SOD活性明顯低于對(duì)照組；GSH-PX特異催化GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[19]，本實(shí)驗(yàn)中，高劑量染毒組及高劑量染毒復(fù)合冷暴露組的GSH-Px活力顯著低于對(duì)照組，隨著染毒劑量的增加GSH-Px活力降低。這表明冷刺激及納米炭黑顆粒染毒均破壞了機(jī)體氧化與抗氧化之間的平衡，從而受到超氧離子自由基和過(guò)氧化氫的攻擊，造成細(xì)胞損傷。丙二醛(MDA) 是體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量高低可直接反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的水平、速率和細(xì)胞受自由基攻擊損傷的程度等，間接地反映細(xì)胞損傷的程度[20]。本實(shí)驗(yàn)中高劑量染毒組，高、低劑量染毒復(fù)合冷暴露組MDA含量顯著高于對(duì)照組，表明高劑量納米顆粒染毒及高劑量納米顆粒染毒復(fù)合冷暴露使機(jī)體產(chǎn)生了大量的氧自由基，但未能及時(shí)清除，從而發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體組織器官受到損害。這與高劑量染毒組、高劑量染毒復(fù)合冷暴露組小鼠SOD和GSH-Px活力顯著降低結(jié)果相呼應(yīng)。

綜上表明，納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露可導(dǎo)致小鼠肺部出現(xiàn)不同程度的氧化應(yīng)激損傷，暴露狀況不同對(duì)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的破壞程度亦不同，但納米炭黑顆粒染毒復(fù)合冷暴露導(dǎo)致小鼠肺毒性的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道大氣顆粒物對(duì)人體健康效應(yīng)的影響，但將納米顆粒物染毒與寒冷暴露結(jié)合起來(lái)，探討復(fù)合因素對(duì)肺組織氧化損傷的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究著眼于納米炭黑顆粒染毒與寒冷暴露對(duì)機(jī)體的共同作用，對(duì)兩者之間內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行的初步分析表明，納米炭黑顆粒復(fù)合寒冷暴露可導(dǎo)致小鼠肺部炎癥反應(yīng)加重，氧化應(yīng)激水平升高，寒冷與納米炭黑顆粒之間無(wú)交互作用，這一結(jié)果可為冬季霧霾天氣對(duì)健康的危害性提供毒理學(xué)基礎(chǔ)。