鎮(zhèn)肝熄風湯對帕金森病大鼠模型紋狀體氧化應(yīng)激的影響

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帕金森病(Parkinson′s disease，PD) 是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，好發(fā)于中老年病人，臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運動遲緩、肌僵直、姿勢步態(tài)異常等[1]。屬于中醫(yī)學顫證、痙病、筋痹等范疇，隨著人口老齡化的日趨明顯，發(fā)病率逐年上升，臨床上治療主要針對帕金森病的發(fā)病機制為腦黑質(zhì) -紋狀體內(nèi)多巴胺減少，遂外源性補充左旋多巴制劑為主要治療藥物。但研究表明，帕金森病人長期應(yīng)用左旋多巴制劑治療會存在癥狀反復(fù)甚至加重，這都表明藥物的效力減弱甚至失效，使病人產(chǎn)生耐藥性，為控制癥狀，不得不加大藥物使用劑量，且藥物本身對人體會帶來不同程度的副作用，致使病人的依從性差，帕金森癥狀難以控制。而中醫(yī)學在控制帕金森病上發(fā)揮了一定的優(yōu)勢，因此本研究旨在觀察中西醫(yī)結(jié)合療法對帕金森病的療效。本課題小組近年來一直致力于臨床研究帕金森病病人在使用左旋多巴基礎(chǔ)上，加用鎮(zhèn)肝熄風湯加減，使帕金森病病人得到較好的治療療效。然而鎮(zhèn)肝熄風湯對帕金森病的治療作用機制未明，本研究通過手術(shù)方法成功建立帕金森病大鼠模型,經(jīng)鎮(zhèn)肝熄風湯灌胃后，觀察帕金森病大鼠的行為表現(xiàn)及大鼠腦紋狀體內(nèi)谷氨酸、谷胱甘肽變化，探討鎮(zhèn)肝熄風湯對帕金森病的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料和試劑 動物頭顱立體定位儀(上海第二軍醫(yī)大學)；微量進樣針 (重慶玻璃儀器設(shè)備廠)；6 -羥基多巴胺 (6 -OHDA Sigma公司)；阿撲嗎啡 (APO，Sigma公司)；氨基酸自動分析儀；722分光光度儀(南京建成生物工程有限公司)；鎮(zhèn)肝熄風湯組方：懷牛膝30 g，代赭石30 g，生龍骨15 g，生牡蠣15 g，生龜板15 g，玄參15 g，天門冬15 g，生白芍15 g，川楝子6 g，生麥芽6 g，茵陳6 g，甘草4.5 g。由山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供標準免煎顆粒。

1.1.2 實驗動物 健康清潔雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(滬)2011 -0005]。

1.2 帕金森病大鼠模型的建立 將60只大鼠隨機分為兩組，模型組50只，正常組10只。模型組大鼠再次隨機分為兩組，40只為造模組，10只為假手術(shù)組。所有大鼠在相同環(huán)境飼養(yǎng)2 周，經(jīng)旋轉(zhuǎn)行為學測試無旋轉(zhuǎn)行為的大鼠經(jīng)手術(shù)造模，參照郭云霞等[2]的造模方法如下：術(shù)前12 h禁食，稱重，6%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上，頭部消毒，沿正中矢狀線暴露顱骨，調(diào)整門齒桿，使前后囟位于同一水平面上，于前囟后4.3 mm，矢狀線右旁開1.5 mm，進針深度7.6 mm，牙科鉆鉆透顱骨，微量注射泵吸取6 -hydroxydopamine( 6 -OHDA) 8 μL，注射速度為1 μL /min，每次注射后留針5 min，緩慢出針，縫合頭皮。假手術(shù)組以等量生理鹽水進行上述操作，正常組不做任何處理。術(shù)后2 周進行旋轉(zhuǎn)行為測試，給大鼠穿上束縛套后置于旋轉(zhuǎn)檢測儀中適應(yīng)5 min，大鼠安靜后皮下注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)，5 min后由旋轉(zhuǎn)檢測儀統(tǒng)一記錄旋轉(zhuǎn)次數(shù)，設(shè)定記錄時間為30min，如大鼠恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)，如30min旋轉(zhuǎn)數(shù)>210 r，則為成功的帕金森病大鼠模型。

1.3 實驗分組及干預(yù)措施 造模成功的30只帕金森病大鼠按隨機原則分為2組，15只為治療組，15只為對照組，同時設(shè)定10只為正常組，治療組給予鎮(zhèn)肝熄風湯灌胃，連續(xù)8 周；對照組、正常組同樣方法給予等量生理鹽水灌胃。

1.4 手術(shù)處理及取材 旋轉(zhuǎn)行為測試：灌胃結(jié)束后進行測試，方法同造模中旋轉(zhuǎn)行為測試法。將模型組及正常大鼠迅速斷頭取腦，分離紋狀體，制成勻漿。

1.5 檢測指標 經(jīng)氨基酸自動分析儀測定谷氨酸。取組織勻漿上清液，通過722分光光度儀用化學比色法測定各組大鼠紋狀體谷胱甘肽含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠旋轉(zhuǎn)行為比較(見表1)

表1 各組大鼠旋轉(zhuǎn)行為比較(±s) r/min

2.2 大鼠紋狀體內(nèi)谷胱甘肽、谷氨酸含量比較(見表2)

組別n谷胱甘肽含量(mg)谷氨酸含量(μg)正常組10 16.60±1.62 62.50±5.02治療組1514.50±1.201)2) 70.80±5.082)對照組15 12.52±0.731)80.60±7.491) 與正常組比較,1)P<0.05;與對照組比較,2)P<0.05。

3 討 論

帕金森病是一種中老年人常見的運動障礙疾病，臨床表現(xiàn)為肢體震顫、運動遲緩、肌僵直和姿勢步態(tài)異常等。其病理特征是由于黑質(zhì) -紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性缺失。據(jù)統(tǒng)計資料表明：65歲以上的中老年人帕金森病患病率達2%以上，目前我國帕金森病病人已超過200萬人。本病的研究歷史將近200年，由于其病因和發(fā)病機制十分復(fù)雜，至今仍未徹底清楚，可能與年齡、環(huán)境因素、遺傳等密切相關(guān)。導(dǎo)致黑質(zhì) -紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性壞死的確切機制尚不完全清楚，目前國內(nèi)外大量研究均提示，氧化應(yīng)激學說成為其發(fā)病的焦點，因此，氧化應(yīng)激學說亦成為科學工作者的研究熱點。正常組織細胞在自身生長、代謝過程中都可產(chǎn)生氧化應(yīng)激產(chǎn)物，如活性氧(ROS)等，在正常情況下，機體存在氧自由基清除系統(tǒng)，腦組織內(nèi)主要有谷胱甘肽等，從而保護機體免遭氧自由基的損傷。而隨著機體的年齡增長，此消彼長，抗氧化系統(tǒng)清除氧自由基的作用逐漸衰退，致氧化應(yīng)激產(chǎn)物不斷增多，這些氧化應(yīng)激產(chǎn)物堆積產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，引起細胞組織相繼損傷、凋亡、破壞，尤其活性氧對黑質(zhì) -紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的破壞更為明顯，導(dǎo)致細胞包括神經(jīng)元變性壞死[3]。不僅如此，氧化應(yīng)激還能產(chǎn)生一些因子促進、加速細胞的變性、壞死的連鎖反應(yīng)，如興奮性氨基酸分泌過多，谷氨酸即為興奮性氨基酸的一種[4]，可使鈣超載從而使細胞線粒體功能受損，導(dǎo)致黑質(zhì) -紋狀體中多巴胺神經(jīng)元變性壞死[5]。因此，本研究的目的是通過鎮(zhèn)肝熄風湯調(diào)節(jié)使抗氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多，如谷胱甘肽等，而使氧化應(yīng)激產(chǎn)物減少，如興奮性氨基酸——谷氨酸等，從而保護黑質(zhì) -紋狀體多巴胺神經(jīng)元。帕金森病因其發(fā)病率呈逐年升高趨勢，及其致殘率高，控制效果差，逐漸成為醫(yī)學專家的研究重點。我國中醫(yī)藥博大精深，目前其尷尬及其困境在于作用機制不明。本課題研究主要探索中醫(yī)藥對帕金森病治療的機制研究。

在中醫(yī)學中帕金森病屬于“顫證”范疇。中醫(yī)學總結(jié)顫證一般分為以下5種證型：肝腎不足、陰陽兩虛、血瘀生風、痰熱動風、氣血兩虛，臨床上以肝腎陰虛最常見。明代醫(yī)學家孫一奎就從中醫(yī)理論角度闡釋了其發(fā)病機制：“此病壯年鮮有，中年以后乃有之，老年尤多，夫年老陰血不足，少水不能制腎火，極為難治”。病人多肝腎陰虛，肝風內(nèi)動，故筋脈失養(yǎng)而致病。遵循中醫(yī)辨證施治原則，臨床上多采用鎮(zhèn)肝熄風湯治療帕金森病，且經(jīng)臨床證實，取得良好效果[6]。鎮(zhèn)肝熄風湯為臨床常用方劑，專為肝腎陰虧、肝陽上亢之證而設(shè)，有鎮(zhèn)肝熄風、滋陰潛陽、止顫等功效。于振章等[7]將68例帕金森病病人隨機分為對照組和治療組，對照組給予美多巴片，并根據(jù)臨床療效調(diào)整劑量；治療組在對照組治療的基礎(chǔ)上起始劑量時加用鎮(zhèn)肝熄風湯加減，觀察治療前后臨床療效，統(tǒng)一用帕金森病評定量表評分，結(jié)果顯示治療組有效率明顯高于對照組。張可可等[8]將56例帕金森病病人，且中醫(yī)辨證均為肝腎陰虛型，隨機分為兩組，對照組給予美多巴等常規(guī)治療，治療組在對照組基礎(chǔ)上加用鎮(zhèn)肝熄風湯加減，結(jié)果顯示：治療組總有效率顯著優(yōu)于對照組，且治療組美多巴用量較治療前明顯減少，病人依從性提高。本實驗小組近3年來在臨床工作中也在潛心研究鎮(zhèn)肝熄風湯加減治療帕金森病的臨床療效，通過研究表明，鎮(zhèn)肝熄風湯能有效控制帕金森病癥狀，且能減少多巴絲肼藥物的使用劑量，減少其不良反應(yīng)及耐藥性的出現(xiàn)。

而本次課題研究的重點在于從機制上研究鎮(zhèn)肝熄風湯對帕金森病的影響，尤其研究其中的氧化應(yīng)激機制。研究結(jié)果表明，鎮(zhèn)肝熄風湯可通過增加帕金森病大鼠腦內(nèi)抗氧化應(yīng)激神經(jīng)遞質(zhì)——谷胱甘肽，減少致氧化應(yīng)激作用增強的興奮性氨基酸——谷氨酸來發(fā)揮作用。