血管鈣化模型大鼠salusin -α表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

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血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和高血壓等多種疾病的病理生理基礎(chǔ)[1]，出現(xiàn)在血管損傷和冠狀動(dòng)脈疾病中，是動(dòng)脈粥樣硬化的必然特征之一[2]，血管鈣化與生理性骨質(zhì)形成類似，是主動(dòng)的、可調(diào)節(jié)的過(guò)程[3]，但具體機(jī)制尚未完全闡明。既往研究表明，許多血管活性因子參與血管鈣化的過(guò)程，本課題組前期實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)一些心血管活性因子參與血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展，如尾加壓素Ⅱ、炎癥因子及醛固酮等[4 -6]，因此，新的血管活性肽對(duì)血管鈣化的機(jī)制研究及防治具有重要意義。

salusins是由28個(gè)氨基酸組成的salusin -α和20個(gè)氨基酸組成的salusin -β兩種活性單體組成。salusin -α作為一種新的血管活性肽可參與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化[7]等多種心血管疾病的發(fā)病過(guò)程，但是否參與血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道，本研究通過(guò)制作維生素D3與尼古丁誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化模型上，觀察salusin -α在血漿和主動(dòng)脈組織中的表達(dá)，初步探討其在血管鈣化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 8周齡雄性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司 [動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012 -0001]。尼古丁購(gòu)自Merck公司，維生素D3購(gòu)自Sigma公司，鈣離子測(cè)試盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；salusin -α試劑盒購(gòu)自北京華英生物研究所。其余為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 血鈣鈣化動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)[8]制備大鼠血管鈣化模型，取16只雄性SD大鼠，體重160 g～180 g，隨機(jī)分為鈣化組和對(duì)照組各8只。鈣化組：08:00維生素D33×105IU/kg肌肉注射， 同時(shí)尼古丁25 mg/kg溶于1 mL花生油灌胃， 18:00重復(fù)灌胃1次。對(duì)照組：類似鈣化組操作，但采用肌肉注射生理鹽水和單純花生油灌胃。兩組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4周后，用3%水合氯醛腹腔麻醉，心臟取血，置入含有乙二胺四乙酸(EDTA)和抑肽酶的試管中，4 ℃離心分離血漿；摘取5 mm 胸主動(dòng)脈，用冰生理鹽水沖洗后，部分石蠟包埋用于染色，-80 ℃儲(chǔ)存待測(cè)。

1.3 Von Kossa染色 將大鼠胸主動(dòng)脈組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，行常規(guī)脫蠟、脫水后浸入5%硝酸銀溶液中，紫外線下照射30 min，再用2.5%硫代硫酸鈉溶液處理1 min定影，然后依次用0.25%堿性品紅復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.4 血管組織ALP活性及鈣含量測(cè)定 將大鼠主動(dòng)脈組織置于液氮中研磨，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清以考馬斯亮藍(lán)法行蛋白定量。分別按照ALP 測(cè)定試劑盒及鈣測(cè)試盒(甲基百里香酚藍(lán)比色法)說(shuō)明書測(cè)定主動(dòng)脈ALP 活性及鈣含量。

1.5 salusin -α含量的測(cè)定 取血漿約200 μL及主動(dòng)脈組織約50 mg(用錫紙包裹)，干冰低溫保存下送北京華英生物研究所檢測(cè)，采用放射免疫法檢測(cè)，具體按說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 血管鈣化大鼠模型的特征 Von Kossa染色可見主動(dòng)脈中膜彈性纖維間黑色顆粒沉積，表明鈣鹽沉積。詳見圖1。

黑色顆粒為鈣鹽沉積。

圖1大鼠主動(dòng)脈Von Kossa染色(×100)

2.2 大鼠主動(dòng)脈組織鈣含量、ALP活性的變化 鈣化組鈣含量及ALP活性明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。詳見表1。

表1 兩組主動(dòng)脈鈣含量與ALP活性比較(±s)

2.3 大鼠血清和主動(dòng)脈組織salusin -α含量的變化 鈣化組大鼠血清和主動(dòng)脈組織中salusin -α的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組血清和主動(dòng)脈組織salusin -α表達(dá)比較(±s)

3 討 論

血管鈣化是一個(gè)主動(dòng)、可調(diào)節(jié)的過(guò)程，血管平滑肌細(xì)胞由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞樣表型是血管鈣化的基礎(chǔ)。病理情況下如氧化應(yīng)激、高血壓、高血糖、高脂血癥以及炎癥反應(yīng)等，可導(dǎo)致血管損傷，可能為血管鈣化始動(dòng)因素或促進(jìn)因素。近年來(lái)，調(diào)節(jié)血管功能的活性因子，尤其是心血管組織產(chǎn)生的旁/自分泌活性肽或活性因子逐漸成為研究的熱點(diǎn)，隨著研究的深入，與血管鈣化相關(guān)的多條信號(hào)通道包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β(TGF -β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)Smad通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路等[9 -10]也成為目前研究的焦點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)尾加壓素Ⅱ、醛固酮和部分炎癥因子等活性因子的表達(dá)均與血管鈣化的程度呈正相關(guān)，提示其促進(jìn)血管鈣化的作用與加重血管損傷或功能受損有關(guān)，且促進(jìn)血管鈣化因子之間對(duì)血管鈣化的發(fā)展有協(xié)同作用。而國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)抑制血管鈣化的因子如Intermedin[11]、Fetuin -A[12]等可保護(hù)血管功能并減輕血管鈣化的程度。因此，尋找新的參與血管鈣化的活性因子對(duì)于闡明血管鈣化的機(jī)制及血管鈣化的防治具有重要意義。

salusins具有促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖、降低血壓并減慢心率和參與細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)，可能與動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病有關(guān)。salusin -α作為一種新的心血管活性肽可延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程，有研究表明salusin -α具有舒張血管、促進(jìn)細(xì)胞增殖等生物學(xué)效應(yīng)[13 -14]，Watanabe等[15]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞中，salusin -α可通過(guò)下調(diào)膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1的表達(dá)，抑制泡沫細(xì)胞的形成，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其與salusin -β的作用可能剛好相反，而在本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)salusin -β可促進(jìn)血管鈣化。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討salusin -α是否是心血管保護(hù)因子。

本研究發(fā)現(xiàn)鈣化組大鼠血漿和主動(dòng)脈組織salusin -α的表達(dá)明顯比對(duì)照組減少，提示salusin -α參與了血管鈣化的發(fā)生與發(fā)展，且可能為新的血管鈣化抑制因子，這一發(fā)現(xiàn)將為血管鈣化的機(jī)制研究及防治提供新的思路。但salusin -α抑制血管鈣化的具體機(jī)制尚不十分明確，有學(xué)者認(rèn)為salusin -α可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑保護(hù)心肌缺血損傷[16]，后續(xù)研究將針對(duì)這一問題進(jìn)行深入探討。