利心沖劑對(duì)心力衰竭大鼠心肌ATP及PCr/ATP比值的影響

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慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是一種復(fù)雜的臨床綜合征，常繼發(fā)于遺傳性或獲得性心臟結(jié)構(gòu)、功能的異常。研究表明，除了神經(jīng)內(nèi)分泌的激活，心肌能量代謝障礙也與慢性心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，改善能量代謝或?qū)⒊蔀樾牧λソ咧委熜碌陌悬c(diǎn)。既往研究顯示，中藥利心沖劑可有效緩解病人心力衰竭癥狀，提高運(yùn)動(dòng)耐量[1]。其對(duì)大鼠心力衰竭模型的作用，表現(xiàn)為調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌及炎性相關(guān)因子[2]，減輕心肌細(xì)胞凋亡[3]，改善心臟功能。為了深入研究中醫(yī)藥治療心力衰竭的機(jī)制，本研究觀察了利心沖劑對(duì)心力衰竭大鼠能量指標(biāo)的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠，雄性，體重200 g～260 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(浙)2014 -0001。

1.2 藥品與試劑 利心沖劑：由黃芪30 g、黃精15 g、補(bǔ)骨脂12 g、葶藶子12 g、益母草30 g組成，采用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的免煎顆粒。三磷酸腺苷(ATP)、磷酸肌酸(PCr)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒由上海源葉生物科技有限公司提供，批號(hào)：1600526。

1.3 建模及分組 參照文獻(xiàn)[4]，采用腹主動(dòng)脈縮窄法制備心臟壓力負(fù)荷超載心力衰竭模型：SD大鼠術(shù)前禁食8 h，稱重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪毛，開腹，暴露腹主動(dòng)脈，將8號(hào)注射器針頭磨鈍，平行置于腹主動(dòng)脈上，用4號(hào)手術(shù)線將腹主動(dòng)脈和注射器針頭一同結(jié)扎，然后緩慢撤出注射器針頭，關(guān)腹，分層縫合。假手術(shù)組除不結(jié)扎外，其他步驟與建立心力衰竭模型大鼠相同。術(shù)后予青霉素腹腔注射5 d，預(yù)防感染。手術(shù)成功2周后，存活大鼠中隨機(jī)選取2只，斷頭處死，取出心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，取左心室心肌部分，以10%甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察確認(rèn)造模成功。

建模成功后將SD大鼠隨機(jī)分為4組， ①假手術(shù)組：等體積雙蒸水灌胃；②模型組：等體積雙蒸水灌胃；③利心沖劑低劑量組：用利心沖劑20 g/kg灌胃；④利心沖劑高劑量組：用利心沖劑40 g/kg灌胃。每組10只，每日1次，連續(xù)28 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心肌病理形態(tài) 給藥結(jié)束后，處死大鼠，取左室心肌部分，經(jīng)10%甲醛固定、取材、脫水、浸蠟、包埋，再切成4 μm厚切片，HE染色，光鏡觀察。

1.4.2 心肌勻漿ATP、PCr檢測(cè) 稱取心肌組織1 g，以2∶1比例加入冷PBS(4 ℃)，勻漿器迅速制備心肌勻漿，3 000 r/min離心5 min，取上清液，-70 ℃溫箱保存。按ATP、PCr的ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè) 假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞漿紋理清晰；模型組心肌細(xì)胞肥大，部分心肌細(xì)胞輕度脂肪變性，部分心肌細(xì)胞肌漿凝聚、核固縮、間質(zhì)出血；利心沖劑高劑量組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與正常相似。詳見圖1。

圖1 大鼠心力衰竭模型心肌細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)

2.2 利心沖劑對(duì)大鼠心肌勻漿ATP及PCr/ATP的影響 與假手術(shù)組比較，模型組、利心沖劑低劑量組ATP含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示心力衰竭時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP含量呈下降趨勢(shì)。與模型組比較，假手術(shù)組與利心沖劑高劑量組PCr/ATP明顯升高(P<0. 05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明利心沖劑治療能夠提升細(xì)胞中的PCr/ATP比值。詳見表1。

表1 各組大鼠ATP及PCr/ATP比較(±s)

3 討 論

人口老齡化以及高血壓病、冠心病等心血管病發(fā)病率的上升，導(dǎo)致心力衰竭的患病率逐年增加。近20年來，心力衰竭治療取得了長足的進(jìn)步，隨著血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARB)、β受體阻斷劑、鹽皮質(zhì)受體拮抗劑等藥物的廣泛應(yīng)用，提高了病人生活質(zhì)量，降低了病死率，使心力衰竭的結(jié)局發(fā)生了極大的變化。但是，現(xiàn)有的治療手段尚不能阻止心力衰竭的發(fā)展進(jìn)程。

對(duì)心力衰竭發(fā)生機(jī)制的研究，目前主要集中在神經(jīng)內(nèi)分泌激活及其所致的心肌重塑。有學(xué)者提出，心肌能量代謝障礙和心力衰竭密切相關(guān)。資料顯示，心力衰竭時(shí)心肌中ATP酶的活性下降，線粒體結(jié)構(gòu)異常，氧化磷酸化過程受損，可使心肌能量的利用發(fā)生障礙，最終導(dǎo)致心肌的收縮儲(chǔ)備降低[5]。除了ATP的合成障礙，ATP傳輸障礙亦可影響心肌細(xì)胞對(duì)能量物質(zhì)的利用。PCr是哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要的磷酸胍類化合物，是心臟內(nèi)能夠迅速動(dòng)用的能量?jī)?chǔ)備[6]。在肌酸激酶的作用下PCr與ATP間能夠完成快速的髙能磷酸鍵轉(zhuǎn)換，為心肌供能。PCr/ATP是衡量心肌能量?jī)?chǔ)備的關(guān)鍵指標(biāo)[7]。

長期的臨床實(shí)踐使得中醫(yī)對(duì)慢性心力衰竭病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)趨于一致：心之氣陽虧虛為本，血瘀、水停為標(biāo)，故治療以益氣溫陽為主要大法，佐以活血、利水。利心沖劑由黃芪、黃精、補(bǔ)骨脂、葶藶子、益母草藥物組成，其中黃芪補(bǔ)益心氣，兼以利水，黃精、補(bǔ)骨脂溫補(bǔ)心腎氣陽，益母草活血利水，葶藶子瀉肺利水。其臨床應(yīng)用取得了滿意的效果，可改善心力衰竭病人的癥狀，提高運(yùn)動(dòng)耐量[1]。前期的機(jī)制研究顯示，利心沖劑對(duì)大鼠心力衰竭模型心肌細(xì)胞具有抑制神經(jīng)內(nèi)分泌和炎性相關(guān)因子的表達(dá)；提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，減輕氧化損傷；抑制凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路p38 MAPK，改變凋亡相關(guān)基因Bcl -2/Bax比值，抑制心肌細(xì)胞凋亡；調(diào)控心肌組織TIMP -1的表達(dá)，抑制由TGF -β誘導(dǎo)的心肌膠原沉積和纖維化，使心室重構(gòu)得到一定程度的延緩或逆轉(zhuǎn)[8]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組與利心沖劑低劑量組ATP含量下降，提示心力衰竭時(shí)大鼠心肌細(xì)胞存在能量代謝障礙。與模型組比較，假手術(shù)組與利心沖劑高劑量組PCr/ATP明顯升高，表明利心沖劑能夠改善心肌能量?jī)?chǔ)備，從而改善心肌細(xì)胞的能量代謝，可能是利心沖劑治療心力衰竭的機(jī)制之一，或?yàn)橹嗅t(yī)藥改善心力衰竭新的治療靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥治療心力衰竭提供了新的思路。