p53、β—連環(huán)蛋白與IL—10聯(lián)合檢測對EB病毒相關性胃癌患者的預后評估的臨床研究

汪維佳 廖志波

【摘要】 目的：以EB病毒相關性胃癌患者為研究對象，探究IL-10作為EB病毒型胃癌篩選生物標志物的可能性以及p53和β-連環(huán)蛋白水平對患者治療后預后評估的價值。方法：納入2014年1月-2015年12月于本院外科接受手術治療的EB病毒型胃癌患者80例，采集患者血液和少量腫瘤組織；采用Trizol法從新鮮冷凍的腫瘤組織中提取DNA，檢測EBV DNA，擴增EBNA-2基因（巢式PCR）和血清學檢測抗體水平；采用免疫組織化學法檢測腫瘤組織p53蛋白、β-連環(huán)蛋白表達及定位情況；采用雙抗體夾心ELISA法檢測血樣中的IL-10水平；采用COX模型進行生存分析。結果：胃癌患者血清抗EB病毒核抗原（EBNA）、IL-10水平均顯著高于對照組（t=12.441、11.832，P<0.001）；p53的陽性表達與低癌細胞分化狀態(tài)、高T分期均存在顯著相關（P<0.01），與有淋巴結轉移也有密切聯(lián)系（P<0.01）；β-連環(huán)蛋白的陽性表達與低癌細胞分化狀態(tài)、淋巴結轉移之間有著密切聯(lián)系（P<0.01）；在6～24個月的隨訪觀察期間，p53陽性患者、β-連環(huán)蛋白陽性患者的生存時間均顯著短于陰性患者（P<0.05）。結論：p53、β-連環(huán)蛋白與IL-10聯(lián)合檢測對EB病毒相關性胃癌的早期診斷和疾病預后評估具有臨床運用價值。

【關鍵詞】 p53； β-連環(huán)蛋白； IL-10； EB病毒； 胃癌

【Abstract】 Objective：To investigate the possibility of IL-10 as a biomarker for EB virus type gastric cancer and evaluate the prognostic value of p53 and β-catenin in the prognosis of patients with EB virus associated gastric cancer.Method：80 patients with type EB virus from January 2014 to December 2015 in our hospital underwent surgical treatment of gastric cancer，the patients blood and a small amount of tumor tissue were collected.DNA was extracted from fresh frozen tumor tissue by Trizol method，EBV DNA was detected，EBNA-2 gene was amplified and antibody level was detected by serology.Detection of the expression and localization of p53 protein，β-catenin in tumor tissues by immunohistochemistry；double antibody sandwich ELISA method was used to detect the level of IL-10 in blood samples；COX model was used for survival analysis.Result：The serum levels of IL-10 against EBV nuclear antigen in gastric cancer patients were significantly higher than those in control group（t=12.441，11.832，P<0.001）；the positive expression of p53 was significantly correlated with the differentiation of low cancer cells and the high T stage（P<0.01），and had a close relationship with lymph node metastasis（P<0.01）.The positive expression of β-catenin was closely related to the low differentiation of cancer cells and lymph node metastasis（P<0.01）.During 6-24 months follow-up，the survival time of β-catenin positive patients was significantly shorter than that of negative patients（P<0.05）.Conclusion：The combined detection of p53，β-catenin and IL-10 has clinical value for the early diagnosis of EB virus related gastric cancer and the evaluation of the prognosis of the disease.

【Key words】 p53； β-catenin； IL-10； EB virus； Gastric cancer

First-authors address：The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University·Yuedong Hospital，Meizhou 514733，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.008

胃癌是世界范圍內發(fā)病率在前五的癌癥之一，且是癌癥相關死亡率第三的癌癥。根據癌癥聚類研究網站（Cancer Atlas Research Network）數(shù)據顯示，胃癌分為4類，包括：EB病毒（EBV）陽性胃癌、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型胃癌、基因組穩(wěn)定型胃癌和染色體不穩(wěn)定型胃癌。世界上每年有超過95萬例的胃腺癌被診斷出來，估計這些病例中有10%患者與EBV感染有關[1-3]。據估計，全球每年約有84 000例EBV相關胃癌被診斷出。EBV陽性的胃癌類型構成EBV相關癌癥中最大的組成部分。盡管如此，現(xiàn)有的文獻中關于胃癌患者血清學成分分析的研究報道尚少[4]。在Chen等[5]的薈萃分析中，僅檢索發(fā)現(xiàn)4篇文獻進行比較胃癌患者與健康志愿者之間血清抗EBV抗體存在的差異。EBV感染相關的特定血清學標志物是監(jiān)測暴露于EBV感染和再激活的有效生物標志物指標。例如，EB病毒衣殼抗原（EBVCA）提示存在潛伏感染，抗EB病毒核抗原（EBNA）和抗早期抗原（EA）提示潛伏感染再激活。此外，許多研究表明免疫抑制細胞因子，如IL-10和轉化生長因子-β（TGF-β）在某些類型的癌癥中誘導EBV再激活，在腫瘤進程中發(fā)揮了重要作用[6]。最近來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的數(shù)據揭示EBV相關腫瘤存在PIK3CA突變、PD-L1/2過表達、EBV-CIMP和CDKN2A沉默表達，以及免疫細胞信號傳導等分子水平特征[7]。同時，EBV感染可通過致癌途徑的激活導致宿主細胞的腫瘤發(fā)生和惡性轉化事件。文獻[8]研究證實，基因改變可能在EBV感染的發(fā)病機制中起重要作用，包括促進病理改變（譬如胃癌）。目前研究表明，p53、β-連環(huán)蛋白和人表皮生長因子受體2（HER2）均與EBV相關性胃癌的發(fā)病機制存在密切關系。因此，研究這些分子改變可能為EBV相關胃癌治療靶點提供潛在的新型生物標志物且為治療預后的評估提供參考依據。本研究以EB病毒相關性胃癌患者為研究對象，探究IL-10作為EB病毒型胃癌篩選生物標志物的可能性以及p53和β-連環(huán)蛋白水平對患者治療后預后評估的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2014年1月-2015年12月于本院外科接受手術治療的EB病毒型胃癌患者80例，所有患者均為幽門螺桿菌陰性。納入標準：（1）符合胃癌診斷標準；（2）手術治療前未進行放療和化療；（3）EB病毒檢測陽性；（4）符合手術治療指針。排除標準：（1）有嚴重心、腦、呼吸系統(tǒng)疾病，無法進行手術治療；（2）存在其他嚴重并發(fā)癥。同時納入由同一病房因胃癌以外的疾病住院的50例患者組成對照組。本研究獲本院倫理委員會的批準，所有納入研究的志愿者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 巢式PCR 采集患者血液和少量腫瘤組織保存于-80 ℃冰箱。采用Trizol法從新鮮冷凍的腫瘤組織中提取DNA，檢測EBV DNA，擴增EBNA-2基因（巢式PCR）和血清學檢測抗體水平。根據文獻[9]所述，根據外顯子3上的EBV LMP-1亞型的PCR結果進行篩選鑒定，野生型為wt-LMP-1、缺失型為del-LMP-1。

1.2.2 免疫組化 將適量胃癌組織置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，而后進行常規(guī)脫水、透明及浸蠟處理；使用萊卡包埋機進行包埋石蠟塊，RM2016切片機進行連續(xù)石蠟切片，厚度5 μm。石蠟切片置于65 ℃烤箱中過夜，而后梯度脫蠟、水化。水化后的組織切片上滴加3%過氧化氫溶液以阻斷內源性過氧化物酶；而后切片進行酸性修復，采用預先配置好的檸檬酸鹽緩沖液，切片置于液體中，采用微波加熱法進行。待修復結束后予以1%BSA室溫封閉30 min，加一抗于4 ℃過夜（p53：1∶800，abcam；β-連環(huán)蛋白：1∶200，abcam）。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶200）于組織切片，室溫孵育1 h。采用DAB顯色后，蘇木素染核1 min，而后進行脫水和中性樹脂封片。采用正置顯微鏡觀察切片陽性信號，并進行計數(shù)統(tǒng)計。免疫組織化學結果定義如下：在至少50%的腫瘤細胞核中存在強p53于核表達被認為陽性結果，在至少10%的細胞質核中存在強β-連環(huán)蛋白表達被定義為陽性結果。免疫組織化學分析同時由兩位病理科醫(yī)生進行。

1.2.3 ELISA法檢測IL-10 于清晨分別采集80例患者與50例健康志愿者的外周血5 mL，即刻送檢，利用雙抗體夾心ELISA法檢測血樣中的IL-10水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0（SPSS Inc，Illinois，USA）統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組間方差不齊用校正t檢驗。相關性分析采用卡方檢驗，生存分析采用COX檢驗。定義P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組的年齡、性別、吸煙、EB相關抗體陽性比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。80例胃癌患者的相關特征參數(shù)分析， GTNM（G為癌細胞分化等級，T為腫瘤組織大小分級情況，N為淋巴結轉移情況，M為轉移情況）分級情況：G1 18例、G2 42例、G3 20例，T1 16例、T2 48例、T3 16例，N0 30例、N1 23例、N2 17例、N3 10例，M0 80例；癌灶部位分布情況：幽門部39例，胃體22例，賁門部59例；EB病毒類型：野生型（wt-LMP-1）59例，缺失型（del-LMP-1）21例。

2.2 兩組血清IL-10、EBNA的表達水平比較 胃癌患者血清抗EB病毒核抗原（EBNA）水平顯著高于對照組（P<0.001）；同時，檢測發(fā)現(xiàn)EB病毒相關的胃癌患者血清IL-10水平明顯高于健康志愿者水平（P<0.001），見表2。

2.3 p53、β-連環(huán)蛋白與EB型胃癌臨床參數(shù)相關性 在80例腫瘤組織中進行p53的免疫組織化學染色，其中20個（25.0%）組織測試為陽性。p53的陽性表達與低癌細胞分化狀態(tài)、高T分期均存在顯著相關（P<0.01），與淋巴結轉移也有密切聯(lián)系（P<0.01）。同時，對80例腫瘤組織進行β-連環(huán)蛋白表達的檢查，結果顯示：β-連環(huán)蛋白的陽性表達與低癌細胞分化狀態(tài)、淋巴結轉移之間有著密切聯(lián)系（P<0.01）。見表3、4。

2.4 生存分析 采用COX函數(shù)對80例患者進行生存分析，分別分析p53陽性、β-連環(huán)蛋白的陽性胃癌患者與陰性患者之間生存情況差異。統(tǒng)計分析結果顯示，在6～24個月的隨訪觀察期間，p53、β-連環(huán)蛋白陽性患者的生存時間均顯著短于陰性患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1、2。

3 討論

胃癌的發(fā)病率在世界范圍內均呈現(xiàn)上升趨勢，其中EB病毒相關性胃癌常見于中青年群體。EBVa胃癌（GC）在年齡50～68歲的患者中更常見，而EBV陰性胃癌在56～72歲患者中更為常見[10]。目前研究已經確定的促進EBVaGC發(fā)生的幾個危險因素，譬如吸煙。在本研究中，60歲以上的男性占據62.5%，其中大多數(shù)（62.5%）是吸煙者。EBV在世界范圍內普遍存在，大約95%的人群可被檢測到EBV相關抗體的存在。據統(tǒng)計，EBNA IgG和EBVCA IgG在癌癥患者和對照組中均比其他抗體檢測更為頻繁[11-12]。在本研究中，胃癌組和對照組中的抗EBVCA和抗EBNA的檢測率相接近，盡管兩個抗體的滴度在各組之間存在差異，這提示兩者在EBVaGC患者中表達水平更高。此外，本研究中72.5%的GC患者中發(fā)現(xiàn)抗EA抗體，且50%患者抗體滴度檢測呈現(xiàn)高效價，而在對照組中僅在8.0%中檢測到，且是低滴度水平。因此，同時具有高抗EBVCA和抗EBNA水平的高抗EA效價可能提示GC患者存在EBV感染的再激活。

免疫抑制因子（如IL-10）在腫瘤進程中發(fā)揮重要作用。EB病毒可表達分泌IL-10因子（vIL-10），其與人IL-10（hIL-10）存在高度同源性，EB病毒在裂解期后期以及在B淋巴細胞感染發(fā)作時可分泌大量vIL-10，導致患者血清IL-10水平明顯上升[13]。此外，文獻[14]研究表明，IL-10水平在GC患者血清中高于對照組，因此可用于預測GC發(fā)生，特別是可用于評估疾病進展。

據報道，p53的突變與胃癌的發(fā)生發(fā)展階段存在密切相關，且EBVaGC組織中晚期和p53過表達之間存在關聯(lián)[15]。然而目前尚對p53與GC預后之間關聯(lián)性的研究報道尚少。迄今為止，免疫組織化學檢測p53表達對胃癌預后的影響仍然存在爭議，一些研究將p53表達缺失與更長的生存期聯(lián)系起來，這意味著p53是一個負面的預后因素。相反，其他研究表明，未發(fā)現(xiàn)p53表達與生存率之間的關系[16-17]。本研究結果表明p53陰性患者存在更長的生存時間。β-連環(huán)蛋白已被證明是Wnt信號級聯(lián)反應的重要介質[18]。作為Wnt信號通路中的一個中心分子，β-連環(huán)蛋白表達位于膜，細胞質和細胞核中。細胞質和細胞核β-連環(huán)蛋白主要參與Wnt信號通路的調節(jié)。β-連環(huán)蛋白在細胞核中累積并激活靶基因的表達程序，并喪失E-鈣粘蛋白，促進上皮-間質細胞進場，促進癌癥發(fā)生。本研究結果表明β-連環(huán)蛋白陰性患者也存在更長的生存時間。

綜上，p53、β-連環(huán)蛋白與IL-10聯(lián)合檢測對EB病毒相關性胃癌的早期診斷和疾病預后評估存在一定的臨床運用價值。

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