線粒體DNA和抗癌藥物的關(guān)系研究進展

賈立明 員麗娜 常誠

【摘要】 線粒體DNA（mitochondrial deoxyribonucleic acid，mtDNA）是一具有16 569堿基對的雙鏈閉環(huán)分子，它包含22個轉(zhuǎn)移核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）和2個核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）基因，并編碼13個有關(guān)細(xì)胞線粒體氧化磷酸化的蛋白多肽。活性氧（Reactive oxygen species，ROS）在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)運途徑中，處于中心環(huán)節(jié)?？拱┧幬镆餸tDNA損害后發(fā)生細(xì)胞凋亡，mtDNA可作為治療癌癥的藥物的靶點。由于mtDNA的結(jié)構(gòu)特點，使得mtDNA較核脫氧核糖核酸（nuclear deoxyribonucleic acid，nDNA）更易受到ROS和DNA的損傷劑的攻擊，造成損害。mtDNA已作為開發(fā)研制抗癌藥物的重要靶點。mtDNA在腫瘤和化療藥物研究中起到重要的作用。本文就抗癌藥物與mtDNA相關(guān)研究做一綜述。

【關(guān)鍵詞】 線粒體DNA； 抗癌藥物； 腫瘤

【Abstract】 Mitochondrial DNA （mitochondrial deoxyribonucleic acid，mtDNA） is a 16 569 base pairs of double closed loop chain molecules，it contains 22 transfer RNA（transfer ribonucleic acid，tRNA） and two ribosomal RNA（ribosomal ribonucleic acid，rRNA） gene，and code 13 relevant cells mitochondrial oxidative phosphorylation protein polypeptide.Reactive oxygen species（ROS） is the central link in the pathway of death in apoptosis.mtDNA is an important target for treating cancer drugs，and some cancer drugs cause mtDNA damage and apoptosis.Because of the structural characteristics of mtDNA，mtDNA makes nuclear deoxyribonucleic acid（nDNA） more vulnerable to attacks by ROS and DNA damage agents.mtDNA has been used as an important target for developing anticancer drugs.mtDNA therefore plays an important role in the study of tumor and chemotherapy drugs.This article reviews the research on anticancer drugs and mtDNA.

【Key words】 Mitochondrial DNA； Anticancer dugs； Tumour

First-authors address：The 264 Hospital of Peoples Liberation Army，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.035

真核細(xì)胞基因組包括核基因組和線粒體基因組，線粒體DNA（mitochondrial deoxyribonucleic acid，mtDNA）和核脫氧核糖核酸（nuclear deoxyribonucleic acid，nDNA）作為真核細(xì)胞基因組的基礎(chǔ)遺傳多肽基因。人類mtDNA是一條具有16 569 bp的雙鏈閉環(huán)分子，它包含22個tRNA基因、2個rRNA基因和13個相關(guān)線粒體氧化磷酸化的蛋白質(zhì)基因，即復(fù)合物Ⅰ包含的7個亞單位（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6），復(fù)合物Ⅲ所含的1個細(xì)胞色素b亞單位，復(fù)合物Ⅳ包

括的CoⅠ、CoⅡ、CoⅢ3個亞單位，以及復(fù)合物Ⅴ的2條6和8亞單位；mtDNA的復(fù)制起始位點在D-環(huán)

（displacement-loop，D-loop），其是mtDNA上的非編碼區(qū)，位于16 028～577 np，約占全部mtDNA的6%，負(fù)責(zé)調(diào)控mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)研究mtDNA的進展，為闡明人類Alzheimer病、衰老、糖尿病及癌癥等疾病的發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)，也為這些疾病的臨床治療提供了思路[2]。mtDNA是抗癌藥物的重要作用靶位，關(guān)于抗癌藥物與癌細(xì)胞mtDNA相互作用的研究已非常普遍。下面就抗癌藥物與mtDNA相互作用的有關(guān)研究做一概述。

1 mtDNA的結(jié)構(gòu)特征

mtDNA同nDNA差異明顯，主要體現(xiàn)在如下方面：（1）mtDNA位于線粒體內(nèi)膜附近，裸露在線粒體基質(zhì)中，且無組蛋白保護；（2）mtDNA過于靠近呼吸鏈，因此更容易受到ROS的侵害；（3）mtDNA的自身修復(fù)系統(tǒng)單一，主要途徑是堿基切除，且修復(fù)效率低下；（4）由于mtDNA內(nèi)不含有內(nèi)含子，且為封閉式雙環(huán)鏈狀，具有高復(fù)制率，抗腫瘤藥物作用的靶點多，并有較強的敏感性；（5）高脂特性和裸露開放性的mtDNA[3]。

依據(jù)mtDNA的結(jié)構(gòu)屬性可以得出，mtDNA的高脂特性和裸露開放性，使其更易與抗癌藥物結(jié)合，以及抗癌藥物能在mtDNA上優(yōu)先聚集。文獻(xiàn)[4]研究結(jié)果顯示，抗癌藥物與mtDNA的結(jié)合更快捷和充分。

2 腫瘤細(xì)胞內(nèi)mtDNA數(shù)量及結(jié)構(gòu)改變

mtDNA離體制品半定量實驗證據(jù)表明，線粒體來源不同組織中mtDNA含量基本相近，1 mg線粒體蛋白含0.2～0.5 μg的mtDNA。而癌細(xì)胞線粒體中的mtDNA含量顯著增多，如大鼠腹水癌細(xì)胞1 mg線粒體蛋白則含有2.5 μg的mtDNA，1個Hela細(xì)胞含有mtDNA能達(dá)到8 800個之多。實驗采用mtDNA（地高辛標(biāo)記）探針原位雜交方法，比較惡性、良性腫瘤細(xì)胞的mtDNA的含量，顯示癌細(xì)胞內(nèi)含的mtDNA拷貝數(shù)顯著增多，推測機制同mtDNA的突變、缺失、重排有關(guān)[5]。

從mtDNA生化特征角度和其研究結(jié)果顯示，癌細(xì)胞、良性腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在mtDNA分子的長度、外形、密度浮力、核苷酸組成比率以及環(huán)二聚體頻率等方面，對比結(jié)果均無顯著的差別[6]。實驗系統(tǒng)地分析了以肺癌為主的人類mtDNA癌細(xì)胞的一級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞mtDNA基因編碼區(qū)的一級結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，重要的核苷酸變異則位于D-loop[7-9]。Barbara等[10]對多種實體瘤細(xì)胞mtDNA的一級結(jié)構(gòu)研究亦有類似發(fā)現(xiàn)?？傮w結(jié)果表明，癌細(xì)胞mtDNA一級結(jié)構(gòu)與正常細(xì)胞無明顯差異。

3 與mtDNA相互作用的抗癌藥物

3.1 核苷類似物 阿糖胞苷（cytarabine，AraC）和吉西他濱（Gemcitabine，dFdC）主要用于腫瘤化療。核苷類似物AraC，需要途徑細(xì)胞膜核苷傳遞系統(tǒng)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，磷酸化后的AraC，最后產(chǎn)生具備細(xì)胞毒性的活性物質(zhì)Ara CTP，進入DNA鏈內(nèi)，阻斷了DNA鏈的持續(xù)擴展，進而阻斷了DNA的合成以及DNA碎片化，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這類核苷類似物經(jīng)過核苷轉(zhuǎn)運體整合進入細(xì)胞中，核苷類似物在細(xì)胞內(nèi)被核苷和核苷激酶磷酸化后，呈現(xiàn)出三磷酸鹽的藥理學(xué)活性模式，三磷酸核苷類似物同脫氧核糖核苷相互競爭成為DNA多聚酶的底物，核三磷酸核苷類似物融入DNA合成鏈上集成，干擾DNA的擴展，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

實驗研究證實了磷酸化后的核苷類似物，大量聚集在線粒體內(nèi)，從而影響mtDNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄；融入mtDNA的核苷類似物，導(dǎo)致線粒體的損害常用是遲發(fā)的，多數(shù)在用藥幾周后出現(xiàn)；文獻(xiàn)[11-12]研究報道，在線粒體磷酸化的核苷類似物摻入mtDNA幾天以后，就能使細(xì)胞死亡。

核苷類似物的熱點研究，多集中在2-chloro-2′-deoxyadenosine（CldAdo，cladribine）上，這是一種脫氧腺苷類似物，現(xiàn)在已被美國食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用治療白血病。CldAdo作為人DNAγ-多聚酶的底物，它可摻入mtDNA，直接干擾mtDNA的延展，并減少線粒體13個多肽mRNA的含量，最終降低線粒體蛋白亞單位的水平，電子轉(zhuǎn)運和氧化磷酸化過程必須有線粒體蛋白亞單位參與[13]。實驗證據(jù)表明，CldAdo能夠有效減輕毛細(xì)胞白血?。╤airy cell Leukemia）患者的病情[14]。

3.2 順鉑 順鉑廣泛應(yīng)用于各類腫瘤的治療，其中包括肺癌、卵巢癌、睪丸癌、頭和頸部腫瘤等。順鉑與nDNA的交和作用后產(chǎn)生了順鉑的細(xì)胞毒性。經(jīng)過實驗研究，已成功分離萃取出了順鉑和脫氧核糖核苷相互整合的產(chǎn)物，包含各種順鉑nDNA的加成物。主要有兩種順鉑nDNA的加成物，Cis-Pt（NH3）2d-（GpG）和Cis-Pt NH3）2d-（ApG），它們占到順鉑nDNA加成物的90%之多[15]。另外，實驗研究發(fā)現(xiàn)，順鉑融合于CHO細(xì)胞24 h后，nDNA加成物濃度要比mtDNA加成物濃度低4～6倍；另有研究顯示，nDNA加成物的形成明顯晚于mtDNA，并且nDNA加成物的清除顯著早于mtDNA[16]。因此說明，作用于癌細(xì)胞的順鉑，能同步影響nDNA及mtDNA，造成DNA的修復(fù)功能缺損，導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[17]。實驗研究顯示，放療同時應(yīng)用順鉑，能夠顯著提升針對mtDNA的損傷，致癌細(xì)胞凋亡加速，進而提高放療的作用[18]。然而順鉑能夠直接造成mtDNA基因片段的缺失，導(dǎo)致懷孕大鼠的腎細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ酶以及胎鼠肝、腎細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ、Ⅳ酶活性顯著減低，動物實驗證明順鉑均能侵害母嬰的細(xì)胞mtDNA，因此臨床上對于孕婦要謹(jǐn)慎用藥。

3.3 親脂陽離子化合物 一個新的Rhodonyanint染料MKT-077，它集結(jié)于癌細(xì)胞的線粒體，并聚焦作用于線粒體位點上，形成親脂性離子化合物電子離域，為今后的抗癌提供了一種新的思路[19]。不管體內(nèi)、體外的癌細(xì)胞，它都對其有選擇性細(xì)胞毒性作用。MKT-077作為抗癌藥已用于Ⅰ期臨床試驗[20]。同其他的親脂陽離子一樣，MKT-077易在線粒體內(nèi)積聚[21]。有人指出通過增加攝取產(chǎn)生的選擇性線粒體毒性，是這類化合物選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)[22]。Modica-Napolitano等[4]在生化和分子水平研究證明了這類化合物具有誘導(dǎo)和選擇損傷線粒體的作用，這就能解釋MKT-077可以具備高選擇性殺死腫瘤細(xì)胞的能力。

3.4 阿霉素 阿霉素是臨床常用的抗腫瘤藥物之一。文獻(xiàn)[23]研究結(jié)果顯示，阿霉素對不攜帶mtDNA的癌細(xì)胞極不敏感，卻對含mtDNA的腫瘤細(xì)胞較敏感。阿霉素的可能作用機制，酶復(fù)合物1將阿霉素還原成半醌自由基，進入線粒體內(nèi)后，參加氧化磷酸化反應(yīng)，產(chǎn)生眾多自由基，這些對生物大分子有高度敏感性的自由基，能侵害mtDNA，從而加快了線粒體及細(xì)胞的進一步損傷或死亡。實驗中將阿霉素同時加入富含線粒體的HSL2細(xì)胞（Rho+，HeLa subline）和缺失線粒體細(xì)胞（Rho0）以后，Rho0細(xì)胞對阿霉素產(chǎn)生了明顯耐藥，Rho+細(xì)胞則對阿霉素極度敏感，而上述這兩種細(xì)胞對其他烷化劑以及γ射線的敏感性試驗，對比結(jié)果則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），文獻(xiàn)[24]研究結(jié)果證明，mtDNA是阿霉素的特異敏感性靶點。實驗采用DNA交聯(lián)檢測方法，將乳腺癌MCF-7細(xì)胞nDNA二氫葉酸還原酶與阿霉素產(chǎn)生的交聯(lián)產(chǎn)物和mtDNA與阿霉素形成的交聯(lián)產(chǎn)物含量作相互對比研究，觀察到每20 000 bp片段可產(chǎn)生1枚交聯(lián)物，且比較兩者之間交聯(lián)產(chǎn)物水平無明顯差異性[25]。GpC島是mtDNA D-loop的特異性序列。文獻(xiàn)[26]研究表明，阿霉素對mtDNA中的GpC島具有高度敏感性，交聯(lián)產(chǎn)物極易形成。這充分證明了mtDNA同阿霉素的細(xì)胞毒性作用密切相關(guān)，也可以解釋阿霉素易引起富含線粒體的心肌細(xì)胞損傷的原因。

3.5 博來霉素 博來霉素常用于鱗狀細(xì)胞癌和淋巴瘤的治療，但常伴隨肺、皮膚、骨髓毒性。經(jīng)博來霉素治療后，會出現(xiàn)線粒體的損害，如腫脹、肥大、數(shù)目減少。Shen等[27]報道用博來霉素處理24 h后的鼠成纖維細(xì)胞，mtDNA由密閉的環(huán)變?yōu)殚_放的環(huán)。Lim等[28]研究結(jié)果顯示，博來霉素最先誘發(fā)mtDNA的單鏈破裂。文獻(xiàn)[28]研究表明，博來霉素在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的急性髓細(xì)胞性白血病（Acute Myelogenous Leukemia，AML）細(xì)胞中損害了mtDNA。觀察到博來霉素可降低AML細(xì)胞的質(zhì)量和基底耗氧量。同時證實mtDNA損傷在博來霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮著重要的作用。mtDNA靶向治療可能是靶向AML細(xì)胞的有效策略，因此博來霉素治療AML將成為可能[29]。

3.6 抗氧化劑 ROS是一種重要的信號分子，它可以調(diào)節(jié)一般的應(yīng)激反應(yīng)。這種對ROS作用的新觀點對研究的解釋產(chǎn)生了明顯的影響，其中抗氧化劑被用于治療與氧化應(yīng)激有關(guān)的人類相關(guān)疾病[30]?？寡趸瘎ˋntioxidants）是能夠防止氧化應(yīng)激損傷的物質(zhì)，能針對氧自由基及時進行捕獲及中和，進而清除氧自由基對人體的傷害。抗氧化劑能夠減輕細(xì)胞的氧化侵害，同時緩解mtDNA突變、缺失、重排帶來的線粒體功能障礙。文獻(xiàn)[31-32]研究顯示，輔酶Q10和維生素E均是將線粒體作為靶位點的氧清除劑，它們能夠清除氧自由基，同時提高人體免疫機能，起到預(yù)防各類疾患以及抗癌等效果，聯(lián)合使用兩者，能充分有效抑制腫瘤的擴散。

n-乙酰半胱氨酸（NAC）作為活性氧清除劑，骨髓細(xì)胞的基因表達(dá)譜顯示了Fasl基因的上調(diào)，NAC可以抑制該基因的表達(dá)。鑒于自然殺傷細(xì)胞通過增強基因編碼的凋亡配體，包括Fasl基因，介導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞的凋亡，其過度表達(dá)將反映骨髓細(xì)胞中常見的淋巴瘤的發(fā)展。文獻(xiàn)[33]觀察表明，NAC可以防止由ROS過量產(chǎn)生的淋巴瘤增殖。近期實驗證實某些中藥，以及其中的活性成分，能夠移除線粒體生產(chǎn)的ROS，黃連堿、葉黃素等則具有強烈的促進生成ROS的作用，藥用植物丹參的根莖提取成分丹酚酸B，丹酚酸B能夠顯著增加射線照射后人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，并增加線粒體的腫脹程度，說明這些藥物具有潛在的修復(fù)線粒體損害或抗癌機能以及增加放療的敏感性[34-35]。另有矛盾的研究結(jié)果，抗氧化劑NAC和維生素E治療會增加前列腺癌風(fēng)險，用其來補充飲食會顯著增加肺癌的進展，并降低B-RAF-k-ras-誘發(fā)型肺癌小鼠模型的存活率[36-37]。

某些抗氧化劑治療腫瘤無效，也許與缺乏特異性作用靶點有關(guān)。由于人體免疫機能系統(tǒng)對ROS變化非常敏感，因此一般的抗氧化劑可以干擾患者發(fā)生惡性腫瘤相關(guān)的生理過程[38]。文獻(xiàn)[39-40]研究表明，靶向線粒體抗氧化劑可以抑制癌細(xì)胞的生長。因此，研究靶向特異性抗氧化劑作為治療癌癥仍還有一定的可行性。

4 展望

mtDNA作為眾多藥物的一個重要靶點，對于研究腫瘤、帕金森病、Alzheimer病、糖尿病的治療有重要意義。鑒于眾多癌細(xì)胞mtDNA的高效復(fù)制率，以及其能夠顯著增加拷貝數(shù)，而且mtDNAD-loop獨有的GpC島、多聚T等特征性的排序，所以，針對mtDNA生化結(jié)構(gòu)特點，研制新型的特異性靶向抗癌藥物已成為一種可能。

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