UFLC-MS/MS法檢測(cè)羊肉湯中罌粟成分

楊崇俊，曲筱靜，李 強(qiáng)，高中勇

（濟(jì)寧市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，山東 濟(jì)寧272000）

食品中濫用罌粟殼會(huì)給食品安全帶來嚴(yán)重隱患[1]。罌粟殼主要含有嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀等成癮性生物堿成分，長(zhǎng)期食用會(huì)對(duì)人體造成危害[2]，因此國(guó)家將罌粟殼列入違禁品予以管制，禁止非法供應(yīng)、運(yùn)輸和使用。但一些不法分子為了經(jīng)濟(jì)利益將其加入到食品中，嚴(yán)重危害人們的健康。

羊肉湯料中的組分十分復(fù)雜，而目前對(duì)食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀等罌粟成分的檢測(cè)如薄層色譜法[3-4]、液相色譜法[5]、氣質(zhì)聯(lián)用法[6]和液質(zhì)聯(lián)用法[7-8]等，均由于操作繁復(fù)且靈敏度不高，不適于羊肉湯的檢測(cè)。經(jīng)參考文獻(xiàn)資料和實(shí)驗(yàn)，本文建立了超快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，檢測(cè)羊肉湯中嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀等罌粟成分，為鑒別是否使用罌粟殼提供了借鑒手段。

1 材料與方法

1.1 試劑

嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自公安部物證鑒定中心。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋，配置成1 mg/mL儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)液；再以甲醇溶解并稀釋，配成10 μg/mL工作液，4 ℃冰箱冷藏儲(chǔ)存。工作液在使用前由儲(chǔ)備液稀釋而成。

碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH=9.0）。

乙酸乙酯、異丙醇、甲醇、乙腈均是色譜純，其余試劑是分析純。

1.2 儀器

美國(guó)API4000Qtrp LC-MS/MS，ESI離子源；島津LC-20A高效液相色譜儀；低溫高速離心機(jī)（8000 r/min ,10 min）；電子天平；渦旋機(jī)；高速振蕩機(jī)；氮吹儀。

1.2.1 質(zhì)譜條件

AB三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜（API4000Q）采用電噴霧模式（ESI+），操作參數(shù)：碰撞氣（CAD）：Midium；氣簾氣（CUR）：25；離子噴射電壓（IS）：5500；霧化溫度（TEM）：500 ℃；GS1：55；GS2：55；篩選分析毒物母離子、子離子，優(yōu)化最佳碰撞電壓（CE）和去簇電壓（DP），MRM檢測(cè)，離子駐留時(shí)間為50 ms，總循環(huán)時(shí)間為0.44 s。

1.2.2 色譜條件

島津20A液相，液相柱為島津Shim-packXRODS（3.0 mm×75 mm，2.2 mm），流動(dòng)相為緩沖液和甲醇，緩沖液為5.0 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸水溶液，流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，10%有機(jī)相開始，流動(dòng)相程序見表1。

表1 流動(dòng)相程序Table 1 The setup and parameters of the mobile phase

1.3 樣品前處理

取5 mL羊肉湯樣品，加入碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液1 mL，渦旋振蕩，加入乙酸乙酯-異丙醇混合液（3:1）5 mL，振蕩10 min，離心（8000 r/min，10 min) ，取上清液，重復(fù)再提取一次，氮?dú)獯蹈桑?0 ℃），用500 μL甲醇溶解，-18 ℃冷凍2 min，離心（8000 r/min，2 min)，上清液過0.22 μm有機(jī)膜，用流動(dòng)相稀釋10倍，進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法特異性

取對(duì)比羊湯空白樣品5 mL，按上述方法檢測(cè)，結(jié)果與標(biāo)樣圖譜比較，未檢出嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀的特征質(zhì)譜峰，說明該方法特異性良好。

2.2 方法檢測(cè)限

取嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因標(biāo)準(zhǔn)工作液添加到空白羊肉湯中，在以上UFLC條件和MRM條件下檢測(cè)，以S/N≥3為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果：羊肉湯樣品中嗎啡含量0.2 ng/mL，S/N=3.6；可待因含量為1.0 ng/mL，S/N=4.1；罌粟堿含量0.05 ng/mL，S/N=3.5；蒂巴因濃度為0.5 ng/mL，S/N=3.1；那可汀濃度為0.1 ng/mL，S/N=4.2。

2.3 方法的基質(zhì)效應(yīng)和回收率

取嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別添加到空白羊湯中，配制成10、50、100 ng/mL 3種濃度的羊湯；各取3份，處理后對(duì)應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行比較，用含有羊湯基質(zhì)的工作液與標(biāo)準(zhǔn)工作液比為基質(zhì)效應(yīng)（ME），添加到羊湯中的與含有羊湯基質(zhì)的工作液比為回收率（RE）。結(jié)果顯示，按照本方法處理，基質(zhì)干擾小，回收率高，均在80%～110%之間，見表2。

表2 羊湯中三種濃度嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因加標(biāo)回收率測(cè)定Table 2 The matrix effect and recoveries of drugs spiked in mutton soup

2.4 方法優(yōu)化

2.4.1 前處理優(yōu)化

罌粟殼中有效成分為嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀等，萃取溶劑采用復(fù)合溶劑，既有弱極性的乙酸乙酯，又有強(qiáng)極性的正丙醇，保證了目標(biāo)物不遺漏。嗎啡含有兩性基團(tuán)，只有pH在7.6～9.0時(shí)，嗎啡才呈現(xiàn)最好分子游離狀態(tài)，故采用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液調(diào)整pH值。

本方法針對(duì)復(fù)雜食品基質(zhì)檢測(cè)，羊湯成分油脂含量高，嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因等含量低，必須經(jīng)有效除油脂才能檢測(cè)，采用-18 ℃冷凍除油脂，方法簡(jiǎn)單易行，效果良好。直接用甲醇溶解濃縮物，甲醇對(duì)罌粟成分有較好的溶解，又可沉淀蛋白，去除蛋白的基質(zhì)效應(yīng)，能為質(zhì)譜檢測(cè)減少基質(zhì)干擾。

2.4.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液做質(zhì)譜圖，采用ESI正離子模式，通過調(diào)整CE、DP電壓，測(cè)得嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因的特征碎片，通過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，它們的碎片穩(wěn)定性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 MRM定性檢測(cè)離子Table 3 Qualitative detection of ions by MRM mode

多離子監(jiān)測(cè)模式（MRM）能最大限度排除各種雜質(zhì)干擾，而且對(duì)于液相色譜分離條件要求較低，化學(xué)性質(zhì)相似的同系化合物即便不能完全分離，采用MRM方法，也能進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量檢驗(yàn)。

2.4.3 色譜條件優(yōu)化

由于嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀在C18色譜柱上保留特性不一致，在流動(dòng)相的選擇過程中，比較了不同梯度的甲醇-水體系和乙腈-水體系，前者的分離效果及柱效明顯好于后者，為了增強(qiáng)分離效果及提高質(zhì)譜中的離子化效率，選擇甲醇-水體系作為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫方法（表1），通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，各目標(biāo)物的保留時(shí)間分別為 1.61、1.79、1.91、1.97、1.99 min，整個(gè)方法用時(shí)僅5 min，同時(shí)用三倍體積的流動(dòng)相通過色譜柱，保證了色譜柱的穩(wěn)定性，結(jié)果證明該方法準(zhǔn)確高效。

3 案例應(yīng)用

2015年3月，某市食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)某家經(jīng)營(yíng)羊肉湯的餐館檢查，懷疑有添加罌粟殼的非法行為，送檢羊湯樣本到我中心檢驗(yàn)。經(jīng)采用本方法檢測(cè)，在所送羊肉湯中檢出了嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀等成分，見圖1。

圖1 羊肉湯中毒品色譜圖Fig.1 Chromatograms of drugs in the detected mutton soup

綜上所述，采用復(fù)合有機(jī)溶劑萃取，低溫除脂，應(yīng)用UFLC色譜法分離，MS/MS選用MRM模式能夠成功檢測(cè)出羊出肉湯中微量嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀等罌粟成分，方法回收率在80%～110%之間，檢出限在1.0 ng/mL以下。實(shí)驗(yàn)和實(shí)踐證明，本方法適應(yīng)于實(shí)際案件的檢驗(yàn)分析。