硬質(zhì)滲透性載體表面接觸DNA的檢驗

嚴安心，王 沖，凃 政，徐秀蘭，徐 珍，陳 靜，李永久

（公安部物證鑒定中心，北京100038）

接觸DNA也稱為脫落細胞DNA，是指通過人體皮膚接觸而遺留在載體表面上的DNA。Wickenheiser[1]的研究表明，每人每天大約會自然脫落400 000個上皮細胞，這成為接觸DNA的主要來源。根據(jù)物質(zhì)交換原理，任何進入犯罪現(xiàn)場的個體只要與現(xiàn)場實物發(fā)生接觸，都會留下接觸痕跡，這成為DNA的檢驗基礎(chǔ)。隨著DNA檢驗靈敏度的不斷提高，大量可能載有接觸DNA的檢材越來越受到辦案人員的重視[2]。載體屬性、提取部位、檢驗策略等多種因素都會影響接觸DNA的檢出率[3]。在眾多種類的檢材中，石頭、混凝土塊等檢材由于受其質(zhì)地堅硬、表面積大、表面粗糙、具滲透性、表面附著物多、組成成分中含PCR抑制物多等因素影響，通常不利于脫落細胞的發(fā)現(xiàn)和提取，是法醫(yī)接觸DNA檢驗的一大難點。本文通過對一起殺人案中石頭、混凝土塊上嫌疑人DNA的成功檢驗，探索了硬質(zhì)滲透性載體上接觸DNA的檢驗方法。

1 案例資料

1.1 簡要案情

某市發(fā)生一起命案，某人被多人毆打，致重度顱腦損傷而死?，F(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的石頭、混凝土塊被推斷系致死工具。有關(guān)單位將石頭、混凝土塊等檢材送檢，要求進行DNA檢驗。

1.2 案件檢驗

1.2.1 熒光檢測

熒光顯現(xiàn)劑由蘇州曉松科技開發(fā)有限公司提供，含有茚二酮、乙酸乙酯、甘油、乙醇、石油醚等成分，工作液按試劑說明現(xiàn)配現(xiàn)用。

熒光顯現(xiàn)：首先使用熒光顯現(xiàn)劑對送檢石頭、混凝土塊表面進行整體噴涂，不留死角，然后在相對濕度小于40%，常溫環(huán)境中放置1 h，晾干（也可在80～85 ℃的環(huán)境下干燥15 min），使用激光物證勘查儀（蘇州曉松科技開發(fā)有限公司提供），選擇發(fā)射波長為 532 nm、光譜半高寬度小于1 nm的激光（綠光）對充分反應(yīng)后的石頭和混凝土塊照射，保持距離在30 cm以上且控制載體表面形成50萬lx的照度，使用只允許540 nm及以上光波通過的濾光鏡（其它光波不能通過）觀察石頭和混凝土塊表面熒光顯現(xiàn)情況。

1.2.2 脫落細胞的收集和DNA 提取

上述1.2.1中出現(xiàn)熒光反應(yīng)的位置，應(yīng)為可能存在脫落細胞的部位，使用生物脫落細胞提取儀（公安部物證鑒定中心研制）進行定點吸附，時間約為20～30 s（每個部位均單獨進行吸附提?。?，取出濾膜，剪碎，置入1.5 mL管中，加入200 μL裂解液（QIAGEN M48 DNA提取試劑盒組分）和20 μL蛋白酶K（5 mg/mL），震蕩后置于56 ℃保溫2 h，離心，取上清。上清液采用QIAGEN M48 DNA提取試劑盒進行濃縮純化。

1.2.3 STR分型檢驗

采用GlobalFilerTMPCR復(fù)合擴增試劑盒擴增，產(chǎn)物經(jīng)3500xL遺傳分析儀檢測，以GeneMapper?ID-X 1.4軟件進行STR分型。操作按試劑、儀器說明書進行。

1.3 檢驗結(jié)果

經(jīng)熒光檢測，觀察到在石頭上有2處疑似接觸痕跡，在混凝土塊上有3處疑似接觸痕跡（部分痕跡的顯現(xiàn)情況見圖1）。對此5處疑似接觸部位分別進行DNA提取檢驗。結(jié)果石頭表面獲得的DNA分型（圖2上）與犯罪嫌疑人任某的一致；混凝土塊表面獲得的DNA分型（圖2下）與犯罪嫌疑人張某某的一致。

圖1 表面接觸痕跡的顯現(xiàn)（箭頭所指為疑似接觸痕跡。a圖載體為石頭; b圖載體為混凝土塊）Fig.1 Exposal of the contact marks (indicated by the arrow)carrying human cells: (A) on the stone, (B) on the concrete block

圖2 石頭表面獲得的DNA分型（上）和混凝土塊表面獲得的DNA分型（下）Fig.2 STR profiling of touch DNA from the surface of stone(upper) or concrete block (bottom)

2 討論

人表皮脫落細胞，雖然多為角質(zhì)上皮細胞，且細胞核多已退化，但在出汗較多、皮膚與物品緊密摩擦的情況下，仍會存留一定量的有核上皮細胞，這些細胞是接觸DNA的主要來源，可以進行DNA檢驗。本文案例，由關(guān)鍵物證疑似致傷工具（石頭、混凝土塊）上獲得嫌疑人的DNA分型是該案DNA鑒定的重點和難點。如果采用整體擦拭或整體吸附的方法提取檢材表面的脫落細胞，會有以下問題：1）物體表面附著的PCR抑制成分將過多地被提取，影響后續(xù)的擴增反應(yīng)；2）本案死者系顱腦損傷，有少量出血，整體提取可能會造成嫌疑人的脫落細胞被受害人的血跡掩蓋或污染，從而影響結(jié)果解讀；3）接觸部位只占物體表面的一小部分，整體提取由于不能準確定位，帶有一定的盲目性，有可能會造成接觸部位的漏提或提取不充分，導(dǎo)致獲得的細胞量不能滿足DNA的檢驗需要。解決上述問題的最佳方案是先定位石頭、混凝土塊上的接觸部位，再進行定點提取，從而在降低干擾物影響的同時提高獲得單一個體DNA分型的可能性。

采用茚二酮熒光顯現(xiàn)劑結(jié)合激光勘查技術(shù)對石頭、混凝土塊表面接觸痕跡進行檢測，使抽象的觸摸部位具象化，而能實現(xiàn)肉眼觀察。原理在于茚二酮能夠與人體汗液中的氨基酸發(fā)生顏色反應(yīng)，在532 nm激光（綠光）照射下會產(chǎn)生高強度的熒光。有研究表明，茚二酮顯現(xiàn)潛在接觸痕跡的靈敏度比DFO（1,8-二氮-9-芴酮）及茚三酮高；熒光效果也強；且在背景復(fù)雜時，可以更好地除去背景的干擾[4]。對于滲透性載體，茚二酮溶液不僅與載體表面的汗液成分反應(yīng)，還能夠與滲透至內(nèi)部的汗液成分反應(yīng)，增加了反應(yīng)產(chǎn)物，進而增強了熒光效果。熒光物質(zhì)本身具有特定的吸收光譜，當激發(fā)光的光譜與熒光物質(zhì)的吸收光譜相耦合時，熒光物質(zhì)分子吸收光能處于激發(fā)態(tài)；因激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將迅速回復(fù)到基態(tài)，從而釋放能量產(chǎn)生熒光。茚二酮與氨基酸反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜與綠光光譜相匹配，在532 nm綠光照射下能夠產(chǎn)生熒光。激光具有方向性好、單色性強、能量高度集中的特點[5]，是激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)光的理想光源。在波長一定時，激光的照度越高，則單位面積上的光通量越大，相同光照面積下所產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)熒光物質(zhì)分子就越多，所激發(fā)的熒光也就越強，檢測的靈敏度相應(yīng)也就越高。本案例中激光物證勘查儀輸出的532 nm激光（綠光）能夠在載體表面形成50萬lx的照度，筆者使用該強度激光成功觀察到接觸痕跡的熒光，而使用多波段光源中的綠光（光譜純度和光照強度都相對較低）進行觀察卻并未發(fā)現(xiàn)明顯的熒光。本案例接觸DNA的分型結(jié)果清晰準確，各基因座等位基因間峰高均衡，無等位基因缺失和非特異性擴增等情況，說明茚二酮熒光顯現(xiàn)劑和激光勘查技術(shù)的應(yīng)用未對DNA的提取和擴增產(chǎn)生不利影響。

針對石頭、混凝土塊等硬質(zhì)滲透性載體上脫落細胞的收集，可以采用棉簽擦拭、負壓吸附和直接刮取等方法，比較這三種方法，負壓吸附法的收集效果更好。一方面，在相同的載體表面積下，負壓吸附比棉簽擦拭收集到的細胞數(shù)量多。再者滲透性載體由于內(nèi)部疏松多空，脫落細胞容易伴隨汗液等滲透其中，棉簽擦拭只能收集表層的細胞，負壓吸附則不僅能收集表層的細胞，還能收集距表層較近的滲透細胞。另一方面，負壓吸附比直接刮取操作簡單，雜質(zhì)也相對較少。石頭、混凝土塊的表面較為堅硬，直接刮取操作也會較為困難；而刮取下來的粉末成分復(fù)雜，PCR抑制物較多，又不利于后續(xù)的擴增實驗。

本文使用茚二酮熒光顯現(xiàn)劑結(jié)合激光勘查技術(shù)成功定位石頭、混凝土塊表面上觸摸痕跡，采用負壓吸附方法收集微量的脫落細胞，通過該“定位-定點吸附-STR分析”的技術(shù)路線，分別獲得了單一個體的DNA分型，本案的成功檢驗對此類硬質(zhì)滲透性載體上接觸DNA的檢驗具有一定的借鑒意義。