靶向人fgl2的微小RNA腺病毒對(duì)裸鼠肝癌皮下瘤的抑制作用

王鳴 習(xí)東 周海荔 寧琴

肝細(xì)胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC) 是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其血供豐富、生長(zhǎng)迅速、惡性程度高、復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率高，這些臨床特征使得HCC總體治療有限。近年來(lái)，探索針對(duì)肝癌的新型生物治療方法成為研究熱點(diǎn)，本研究所與公司合作，成功研發(fā)制備靶向人纖維介素蛋白(fibrinogen-like protein 2,fgl2)的微小RNA腺病毒注射液(Ad-hfgl2-miRNA)，本文旨在比較不同劑量Ad-hfgl2-miRNA對(duì)裸小鼠人肝癌皮下荷瘤生長(zhǎng)的抑制作用，為進(jìn)一步的肝癌靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMSO(D2650)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；臺(tái)盼藍(lán)染液(貨號(hào)G1019)購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4周齡SPF級(jí)雄性balb/c-nu裸鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，體重20～22 g，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，恒溫恒濕條件下供應(yīng)高壓滅菌墊料、飼料、飲水。本部分試驗(yàn)過(guò)程均需在無(wú)菌條件下執(zhí)行。

3.細(xì)胞 細(xì)胞系及病毒人肝癌高侵襲性細(xì)胞(HCCLM3)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)并由本研究所保存，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。Ad-hfgl2-miRNA注射液由本研究所獨(dú)立開(kāi)發(fā)制備。

二、裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型建立

收集T75 cm2培養(yǎng)瓶中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3細(xì)胞，按1×107/ml為目標(biāo)濃度。選取裸鼠背部靠近前肢的皮下并避開(kāi)血管密集部位為注射點(diǎn)，酒精棉球?qū)ζ溥M(jìn)行消毒，將注射器中HCCLM3細(xì)胞搖勻，輕輕插入裸鼠背部皮膚，200 μl/只。術(shù)后每日觀察祼鼠狀態(tài)及皮下移植瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量并記錄其最長(zhǎng)直徑(a)，最短直徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(腫瘤體積=1/2×a×b2)，待發(fā)現(xiàn)腫瘤顯著增大，腫瘤體積>100 mm3時(shí)，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組，分別為高劑量干預(yù)組(3.3×1010IU)、中劑量干預(yù)組(1.0×1010IU)、低劑量干預(yù)組(3.3×109IU)、陰性對(duì)照組。每組入組6只裸鼠。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、實(shí)驗(yàn)方法

瘤內(nèi)注射Ad-hfgl2-miRNA注射液在入組當(dāng)天按設(shè)定劑量分別瘤內(nèi)多點(diǎn)注射3.3×1010、1.0×1010、3.3×109IU腺病毒注射液及非相關(guān)對(duì)照(Ad-neg-miRNA)，每6天干預(yù)1次，共干預(yù)4次，不同時(shí)間點(diǎn)觀察腫瘤大小變化，計(jì)算腫瘤體積、相對(duì)腫瘤體積和相對(duì)腫瘤增殖率。相關(guān)計(jì)算公式如下：相對(duì)腫瘤體積(RTV)=Vt/V0(V0為首次干預(yù)時(shí)腫瘤體積，Vt為干預(yù)后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)量的腫瘤體積)；相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)%=TRTV/CRTV×100%(TRTV：干預(yù)組的RTV，CRTV：非相關(guān)對(duì)照組的RTV)。原則上T/C%≤40%，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P<0.05即為有效。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤裸鼠皮下移植瘤動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)變化

分別于第1次干預(yù)后第1、3、5、7、10、13、16、19天測(cè)量腫瘤體積，各組腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化如圖1及表1所示，治療終點(diǎn)，即干預(yù)后第19天剝離腫瘤，大小及形態(tài)如圖2所示，自干預(yù)第10天時(shí)，高、中、低劑量干預(yù)組平均腫瘤體積均小于非相關(guān)對(duì)照組，第10天時(shí)腫瘤大小分別為(523.0±44.2)mm3、(543.2±16.5) mm3、(622.4±82.9) mm3、(1 042.0±138.8) mm3，各干預(yù)組與非相關(guān)對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此后每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)，各個(gè)干預(yù)組的平均腫瘤體積均小于對(duì)照組，至治療第19天，腫瘤體積分別為(307.2±22.3)mm3、(757.8±52.5) mm3、(1 042.0±50.1) mm3、(2 351.0±593.7) mm3，各干預(yù)組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)干預(yù)劑量越高，腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用越明顯，表明Ad-hfgl2-miRNA注射液對(duì)肝癌生長(zhǎng)有抑制作用，且抑制效果和劑量有一定依賴關(guān)系。

二、不同時(shí)間點(diǎn)各干預(yù)組荷瘤裸鼠的相對(duì)腫瘤體積

在干預(yù)后第10天、13天、16天、19天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，高、中劑量干預(yù)組的相對(duì)腫瘤體積均顯著小于非相關(guān)對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而低劑量干預(yù)組與非相關(guān)對(duì)照組相比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3，表2)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤裸鼠腫瘤體積大小±s,mm3)

圖1 荷瘤裸鼠皮下移植瘤動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)變化

圖2 治療終點(diǎn)剝離的各組裸鼠皮下移植瘤

表2 各組不同劑量荷瘤裸鼠各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)腫瘤體積±s)

三、不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤裸鼠皮下移植瘤的相對(duì)腫瘤增殖率

在干預(yù)后第16天，高、中、低劑量組相對(duì)腫瘤增殖率分別為28.37%、47.50%、57.65%，第19天時(shí)各組相對(duì)腫瘤增殖率分別為17.86%、44.50%、53.31%，其中從第16天開(kāi)始，高劑量干預(yù)組的相對(duì)腫瘤增殖率均小于40%(表3)，干預(yù)效果顯著。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤裸鼠皮下移植瘤的相對(duì)腫瘤增殖率(%)

注：D3、5、7、10、13、16、19分別為第3天、5天、7天、10天、13天、16天、19天

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)各干預(yù)組荷瘤裸鼠的相對(duì)腫瘤體積

討 論

HCC是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例超過(guò) 60萬(wàn)例，是全世界第5常見(jiàn)的腫瘤，在男性中，其病死率繼肺癌之后已躍居第2[1]。每年約75 萬(wàn)病人因HCC 死亡，在腫瘤相關(guān)性死亡中排第2 位[2]。超過(guò)80%的HCC發(fā)生在非西方國(guó)家，其主要危險(xiǎn)因素有慢性病毒感染、酒精、鐵過(guò)量、黃曲霉素 B1、霉菌毒素、代謝因素等[3]。目前，基于HCC病人的全身狀況、肝功能、腫瘤大小及數(shù)目、血管侵犯、肝外轉(zhuǎn)移等因素考慮，針對(duì)肝癌的治療主要有手術(shù)切除、肝移植、消融術(shù)、化療栓塞、靶向治療等[4]，但總體治療效果欠佳。

生物治療作為HCC綜合治療的新模式已受到越來(lái)越多的重視，包括靶向治療、免疫治療、基因治療等。作為富血管腫瘤，HCC微環(huán)境中多個(gè)與血管新生信號(hào)通路相關(guān)的分子表達(dá)均上調(diào)，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived endothelial cell growth factor,PDGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)、fgl2等，這些分子與腫瘤血管新生密切相關(guān)，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用[5]，阻斷促血管生成相關(guān)因子的表達(dá)在腫瘤抗血管新生治療方面具有潛在的應(yīng)用前景。索拉非尼是目前唯一獲批用于肝癌的靶向藥物，其不僅能夠抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長(zhǎng)，也可以通過(guò)抑制VEGF和PDGF受體阻斷腫瘤新生血管的形成，從而間接地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，它還被認(rèn)為是多種酪氨酸激酶受體抑制劑，能夠阻斷腫瘤的形成。一系列臨床試驗(yàn)，包括Ⅲ期臨床試驗(yàn)SHARP研究與ORIENTAL研究的分析結(jié)果，印證了索拉非尼治療HCC具有顯著療效[6-7]。目前，已有多達(dá)50余種類似藥物還在研究中，如Brivanib[8](針對(duì)VEGF及FGF)、Erlotinib[9](針對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的拮抗劑)、PD-1抑制劑[10]等。

Fgl2已被證實(shí)在HCC等多種惡性腫瘤的實(shí)質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)浸潤(rùn)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)廣泛表達(dá)，并與纖維蛋白沉積有密切組織學(xué)關(guān)系[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，fgl2基因敲除的高侵襲性人肝癌細(xì)胞系HCCLM6表達(dá)IL-8、VEGF的能力較對(duì)照組顯著下降，應(yīng)用裸鼠角膜血管新生模型顯示fgl2基因沉寂后的人肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的能力顯著降低，證實(shí)了fgl2與腫瘤血管新生的密切關(guān)系，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，fgl2在腫瘤微環(huán)境中以凝血依賴的方式激活p38-MAPK和ERK途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和血管新生[12]，此外，肝星狀細(xì)胞通過(guò)分泌可溶性fgl2，抑制腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的增殖，參與肝癌負(fù)性免疫微環(huán)境的形成，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展[13]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，fgl2基因沉默后裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)受到顯著抑制，誘導(dǎo)血管新生的能力亦顯著降低[14]，表明敲除fgl2基因有望成為治療HCC的新策略。

隨著研究的不斷深入，基因治療已成為包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病新的治療模式?；蛑委煶Ｓ玫妮d體系統(tǒng)包括病毒載體和非病毒載體。與非病毒載體相比，腺病毒載體基因沉默持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，效果更好[15]，而與其他病毒載體如慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，腺病毒載體又具有不整合到宿主細(xì)胞基因組、高效感染宿主細(xì)胞、易于復(fù)制、易于操作、可感染分裂細(xì)胞也可感染靜止期細(xì)胞、安全性高等特點(diǎn)，因此，腺病毒載體在基因治療的研究中得到了廣泛應(yīng)用[16-17]。RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)是一種由內(nèi)源性或者外源性雙鏈DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)[18],可通過(guò)miRNA和小干涉RNA(siRNA)來(lái)實(shí)現(xiàn)[19]，該技術(shù)目前已廣泛用于傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域[14,20-21]。本研究所采用miRNA技術(shù)及腺病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建靶向人fgl2的微小RNA腺病毒(Ad-hfgl2-miRNA)，以保證RNAi序列正確且高效轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞并表達(dá)，結(jié)果表明，Ad-hfgl2-miRNA腺病毒注射液可顯著抑制裸鼠人肝癌皮下瘤生長(zhǎng)，且干預(yù)效應(yīng)和劑量有一定依賴關(guān)系，其中，高劑量干預(yù)組的相對(duì)腫瘤抑增殖率均小于40%，干預(yù)效果顯著，為探索肝癌基因治療提供了新的途徑。

盡管基因治療在導(dǎo)入基因如何高效持久表達(dá)、免疫性、倫理問(wèn)題、載體的靶向性和基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的可控性等方面尚存在局限性，但只要我們堅(jiān)持認(rèn)真科學(xué)的態(tài)度,設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床研究方案，基因治療將很快在疾病治療的臨床選擇方案中占據(jù)一席之地。