梵凈山石斛無菌播種及快繁技術(shù)

余水生，付雙彬，鄭英茂，李成惠，程筵壽，楊燕萍*

(1.浙江九龍山國家級自然保護區(qū)管理局，浙江 遂昌 323300； 2.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005；3.遂昌縣林業(yè)局，浙江 遂昌 323300)

梵凈山石斛(Dendrobiumfanjingshanense)為蘭科石斛屬多年生草本植物，是2001年在貴州省梵凈山黑灣河海拔800～1 500 m處發(fā)現(xiàn)的一個新種[1]。自發(fā)現(xiàn)之時起，一直被認為是貴州特有藥用植物之一[2]。直到2010年，葉喜陽等[3]在浙江九龍山國家級自然保護區(qū)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了梵凈山石斛的分布。九龍山國家級自然保護區(qū)是目前浙江省唯一一處記載梵凈山石斛分布的區(qū)域。梵凈山石斛是一種珍稀名貴的中草藥，性味甘淡微咸，寒，歸胃、腎，主要用于治療口干、煩渴、熱病傷津、肺熱干咳、腰膝軟弱、陰傷目暗等病癥[4]。另外，其花黃褐色或橙黃色，也可作觀賞植物，具有較高的觀賞價值。因而導(dǎo)致了大規(guī)模的采挖和頻繁發(fā)生非法出口，目前正面臨著瀕危的狀態(tài)，然而靠傳統(tǒng)的分株繁殖方式，很難起到保育作用。由于梵凈山石斛種子微小，胚胎發(fā)育不完全，在自然條件下種子通常要與真菌共生才能萌發(fā)，造成其種子發(fā)芽極為困難。因此采用無菌播種技術(shù)為梵凈山石斛快速繁殖及開發(fā)利用提供技術(shù)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以梵凈山石斛開花2 d后進行自交授粉120 d的蒴果為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒滅菌

將梵凈山石斛的蒴果用流水沖洗2 h后，在超凈工作臺上用質(zhì)量分數(shù)75%的酒精浸泡30 s，再然后用無菌水沖洗3次，再用質(zhì)量分數(shù)0.1%HgCl2消毒10～12 min，最后用無菌水沖洗5次。

1.2.2 種子萌發(fā)培養(yǎng)基的選擇

將處理好的蒴果放在無菌操作臺上的培養(yǎng)皿中，先切除兩端(0.5 cm)，然后把蒴果切開，均勻地灑在MS、1/2MS、B5、KN和花寶1號培養(yǎng)基中，附加6-BA和NAA各0.5 mg·L-1，以及10%椰汁(CM)，活性炭(AC)含量為1.0 g·L-1，蔗糖質(zhì)量濃度為30 g·L-1，瓊脂為6.8 g·L-1。隨時觀察萌發(fā)情況，60 d后統(tǒng)計萌發(fā)率和生長情況。

1.2.3 原球莖增殖培養(yǎng)基篩選

將萌發(fā)培養(yǎng)基上的原球莖轉(zhuǎn)入到增殖培養(yǎng)基上，采用L16(45)的正交試驗設(shè)計設(shè)置不同基本培養(yǎng)基(1/2MS、KC、B5、VW)、6-BA濃度(1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1)、NAA濃度(0、0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、AC含量(0、0.5、1.0、2.0 g·L-1)等4個因素對梵凈山石斛增殖的影響，40 d后統(tǒng)計增重并計算增殖倍數(shù)。

1.2.4 原球莖分化與叢生芽增殖

將增殖的原球莖轉(zhuǎn)接入基本培養(yǎng)基1/2MS中，添加6-BA濃度(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)和生長素NAA濃度(0.1、0.2、0.5 mg·L-1)組合的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中AC含量為2 g·L-1、蔗糖質(zhì)量濃度30 g·L-1、瓊脂6.8 g·L-1，每個組合培養(yǎng)基為10瓶，每瓶10個原球莖，30 d后統(tǒng)計分化芽數(shù)及生長情況，60 d后統(tǒng)計叢生芽數(shù)并計算增殖系數(shù)。

1.2.5 生根誘導(dǎo)

待叢生芽長至2 cm高時轉(zhuǎn)接入1/2MS培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA(0.5、1.0、2.0 mg·L-1)和IBA(0.2、0.5、1.0 mg·L-1)到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，AC含量為2 g·L-1，蔗糖質(zhì)量濃度為30 g·L-1，瓊脂7.7 g·L-1。每個組合培養(yǎng)基為10瓶，每瓶2～3個分化小芽，每隔3～4 d觀察培養(yǎng)基中的情況，30 d后統(tǒng)計生根率、觀察根系生長狀況。

1.2.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室環(huán)境的溫度為(22±2)℃，光照強度為2 000 lx，日光照時間為12 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)

將梵凈山石斛的種子接到為MS、1/2MS、KN、B5、花寶1號及附加BA、NAA濃度為0.5 mg·L-1的萌發(fā)培養(yǎng)基上，觀察種胚萌發(fā)率和生長差異較大。種子接入培養(yǎng)基20 d后，在培養(yǎng)基KN+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+10%CM+AC 2.0 g·L-1上可見到白色圓球莖；60 d后，原球莖由白轉(zhuǎn)綠，出現(xiàn)芽苗。

由表1可見，供試種子在不同培養(yǎng)基上萌發(fā)程度不同。以KN+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+10%CM+AC 1.0 g·L-1培養(yǎng)基上效果最優(yōu)，萌發(fā)率可達95.5%；在培養(yǎng)基B5+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+10%CM+AC 1.0 g·L-1中萌發(fā)效果差，萌發(fā)率僅有85.6%；在花寶1號+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+10%CM+AC 1.0 g·L-1培養(yǎng)基中，萌發(fā)率可達93.3%，可見培養(yǎng)基的鹽分組合與鹽濃度是影響種子萌發(fā)的因素之一，不同的鹽分組合與高濃度鹽成分可能會抑制梵凈山種子萌發(fā)，在培養(yǎng)基中附加椰汁與活性炭有助于種子的萌發(fā)。

表1 不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響

2.2 原球莖增殖

不同基本培養(yǎng)基、植物激素的種類與配比濃度及添加物共同使用對原球莖增殖有重要作用。由表2可知，在極差分析中，培養(yǎng)基類型對原球莖增殖影響最大，其次是AC含量。由此可見，各因素對梵凈山石斛原球莖增殖的影響程度依次是培養(yǎng)基類型>AC含量>6-BA>NAA。根據(jù)K值大小及培養(yǎng)基類型，6-BA和NAA濃度，以及AC含量各因素水平間的比較，得出原球莖增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為B5+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1。

2.3 叢生芽分化與增殖

將增殖后的原球莖轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基C1～C9中，誘導(dǎo)不定芽分化與增殖。表3結(jié)果表明，最適合梵凈山石斛不定芽分化的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+10%土豆泥+AC 2.0 g·L-1，分化芽數(shù)達1.6個，隨著6-BA濃度的升高，不定芽的分化呈下降趨勢，說明低濃度的6-BA對不定芽的分化有促進作用。不定芽增殖培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+10%土豆泥+AC 2.0 g·L-1，而隨著6-BA濃度的升高，NAA濃度的降低，不定芽增殖系數(shù)呈上升趨勢。

2.4 生根誘導(dǎo)

待叢生芽長至2 cm高時轉(zhuǎn)接入1/2MS培養(yǎng)基，附加10%土豆泥，AC含量 2.0 g·L-1。在此基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，添加不同濃度的生長素NAA或IBA的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(D1～D6)。培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)，在莖基部開始長出較細的不定根，約2個月后即可獲得根系發(fā)達，生長旺盛的完整植株(表4)。

表2 不同培養(yǎng)基對原球莖增殖的影響

表3 不同濃度的BA、NAA對不定芽分化與增殖的影響

表4 不同濃度NAA、IBA對不定芽生根誘導(dǎo)的影響

選用不同的生長素種類與濃度因不同植物而定，只有滿足植物生根所需的激素濃度與配比，才能提高生根率和成活率。在各激素處理中，以NAA低濃度(0.5 mg·L-1)處理對梵凈山石斛的生根效果最好；而IBA濃度(0.2 mg·L-1)處理對梵凈山石斛苗生根生長的效果最差。說明高濃度NAA不利于梵凈山石斛的生根，因此在梵凈山石斛生根過程中添加0.5 mg·L-1NAA是較適宜的，附加土豆泥和活性炭對組培苗生根有促進作用。

3 小結(jié)與討論

梵凈山石斛由于具有較高的觀賞價值與經(jīng)濟價值，因而廣受歡迎。目前采用無菌播種方法生產(chǎn)種苗是解決種苗短缺一種快速有效的途徑。由于無菌播種生產(chǎn)的種苗后代不一致，穩(wěn)定性差，因此在采用無菌播種進行梵凈山種苗生產(chǎn)時，要對父母本進行嚴格選擇，以確保后代性狀盡可能一致。

梵凈山石斛在組培中對激素種類、濃度和營養(yǎng)狀況的要求較高，適宜的激素配比可大大提高梵凈山石斛的快速繁殖能力?；九囵B(yǎng)基、植物激素的種類與配比濃度及添加物組合使用對梵凈山石斛組織培養(yǎng)過程中種子萌發(fā)、原球莖誘導(dǎo)、增殖、不定芽分化與增殖以及生根誘導(dǎo)等方面產(chǎn)生重要的影響[6-10]。在種子萌發(fā)階段，KN基本培養(yǎng)基無機鹽含量較低，能滿足種子萌發(fā)所需的礦物營養(yǎng)，而高濃度的礦物營養(yǎng)會影響種子萌發(fā)，故采用KN+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+10%CM+AC 1.0 g·L-1培養(yǎng)基效果較為理想，種子萌發(fā)率可達95.5%，且萌發(fā)多成團狀。在原球莖增殖階段，培養(yǎng)基類型對原球莖增殖影響最大，其次是AC含量。由此可見，各因素對梵凈山石斛原球莖增殖的影響程度依次是培養(yǎng)基類型>AC含量>6-BA>NAA，得出較優(yōu)培養(yǎng)基為B5+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+AC 0.5 g·L-1；在不定芽分化與增殖培養(yǎng)中，6-BA濃度對梵凈山石斛原球莖分化與不定芽增殖也有重要的影響，其中以低濃度6-BA對不定芽的分化有促進作用，而不定芽的增殖隨著6-BA濃度的升高增殖系數(shù)呈上升趨勢，因此篩選出1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+10%土豆泥+AC 2.0 g·L-1培養(yǎng)基分化芽數(shù)較高，為1/2MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+10%土豆泥+AC 2.0 g·L-1培養(yǎng)基能有效提高其增殖系數(shù)。梵凈山石斛生根過程添加NAA為0.5 mg·L-1是較適宜的，附加土豆泥和活性炭能促進組培苗生根。因而采用組培快繁

技術(shù)使梵凈山石斛野生資源得到保護從而進一步開發(fā)利用，推進其保育工作。