堿解蒸餾法測定土壤水解性氮含量

林永鋒，劉曉菲，李廷釗,2，董剛強*

(1.安利(中國)植物研發(fā)中心，江蘇 無錫 214145； 2.安利(中國)研發(fā)中心，上海 201203)

土壤水解性氮，通常也稱土壤有效氮，是銨態(tài)氮，硝態(tài)氮，氨基酸、酰胺和易水解的蛋白質(zhì)氮的總和。作為一項主要的土壤氮素分析項目，與土壤全氮量相比，它更能反映土壤近期內(nèi)的氮素供應(yīng)狀況和氮素釋放速率，是反映土壤供氮能力的指標之一，與作物生長關(guān)系密切[1]。

目前，土壤水解性氮的測定方法主要有生物培養(yǎng)法[2-4]、酸水解法[5-6]、堿解擴散法和堿解蒸餾法等[7-9]。培養(yǎng)法過程復(fù)雜，在生產(chǎn)中難以應(yīng)用。酸水解法適用于有機質(zhì)含量較高的土壤，但在有機質(zhì)缺乏的土壤上測定結(jié)果并不十分理想。林業(yè)行業(yè)標準中規(guī)定采用堿解擴散法。此法不但操作煩瑣、檢測時間長，而且因一些不可避免的設(shè)計缺陷，使得結(jié)果重現(xiàn)性差，甚至有時會發(fā)生錯誤。例如：堿解使用濃度較大的氫氧化鈉與吸收液硼酸，二者同在一個容器(擴散皿)的內(nèi)外室中，極易發(fā)生相互污染，導(dǎo)致結(jié)果偏高；玻璃板不能與擴散皿完全密封會導(dǎo)致氨氣逸出，造成結(jié)果偏低。堿解蒸餾法能很好地避免這些問題，并能提高檢驗的準確性和速度。關(guān)于堿解蒸餾法測試土壤水解性氮含量已有部分報道，但由于實驗儀器和環(huán)境條件存在差異，測定結(jié)果不盡相同[10-12]。本文在前人試驗的基礎(chǔ)上，利用FOSS Kjeltec 8400全自動定氮儀對堿解蒸餾法測試土壤水解性氮的條件進行了優(yōu)化，在保證數(shù)據(jù)準確性和穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上提高了測試效率，可為土壤分析工作提供參考?，F(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗原理

將土壤樣品置于自動定氮儀中，用一定濃度的氫氧化鈉和鋅-硫酸亞鐵進行還原和水解，使硝態(tài)氮和其他易水解氮轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮，經(jīng)蒸餾后被定量吸收在硼酸溶液中，控制一定的時間或蒸餾體積，用標準酸進行滴定，計算水解性氮含量。

1.2 供試材料

購買國家有證標準土壤樣品作為土壤有效態(tài)成分分析標準物質(zhì)，包括ASA-8(新疆灰鈣土)、ASA-9(陜西黃棉土)、ASA-10(安徽潮土)、ASA-1a(遼寧棕壤)。另采集不同區(qū)域土壤作為樣本：S1，采自江蘇無錫，水稻土，于2013年12月采集，當季種植菊花；S2，采自江蘇無錫，水稻土，于2013年12月采集，當季種植菊花；S3，采自江蘇無錫，水稻土，于2014年11月采集，當季種植豆科類等綠肥；S4，采自寧夏中寧，灰鈣土，于2014年5月采集，當季種植枸杞；S5，采自甘肅岷縣，黑土，于2014年9月采集，當季種植黨參；S6，采自四川中江，紫色土，于2014年6月采集，當季種植丹參；S7，采自陜西洛川，黃棉土，于2013年12月采集，當季種植菊花。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器

Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀，瑞典FOSS公司；T50 M自動電位滴定儀，梅特勒-托利多；Mettler XP204萬分之一天平，梅特勒-托利多。其他儀器包括恒溫箱，擴散皿(外室直徑10 cm)，毛玻璃，5 mL半微量滴定管，250 mL消化管，小毛刷，橡皮筋。

1.3.2 試劑

所用試劑除另有說明外，分析時均使用符合國家標準的分析純化學(xué)試劑和去離子水。

1.2、1.8、4、5、6、7、8 mol·L-1的NaOH溶液。分別稱取48.0、72.0、160、200、240、280、320 g氫氧化鈉溶解于水，定容至1 L。

10 g·L-1硼酸-指示劑混合液(全自動定氮儀使用)。稱取50.0 g硼酸溶解于水中，定容至5 L。硼酸溶液中加入50 mL 0.1%溴甲酚綠和35 mL 0.1%甲基紅，調(diào)節(jié)至紅紫色。此液放置時間不宜過長，如在使用過程中pH值有變化，隨時用稀酸或稀堿調(diào)節(jié)。

20 g·L-1硼酸-指示劑混合液(堿解擴散法使用)。稱取20.0 g硼酸溶解于水中，定容至1 L。使用前每100 mL硼酸溶液中加入2 mL甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑(稱取0.099 g溴甲酚綠和0.066 g甲基紅于研缽中研細，溶解于100 mL乙醇中，該指示劑貯存期不超過2個月)，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至紅紫色。

1 mol·L-1HCl標準溶液(全自動定氮儀使用)。吸取9 mL濃HCl溶液于1 000 mL容量瓶中，用水稀釋定容。采用自動滴定儀測定標準酸濃度。

0.01 mol·L-1的HCl標準溶液(堿解擴散法使用).將0.1 mol·L-1HCl標準溶液準確稀釋10倍。

Zn-FeSO4·7H2O混合還原劑。50.0 g磨細并通過0.25 mm篩孔的硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)和鋅粉10.0 g 混勻，貯存在棕色瓶中。

堿性膠液。40 g阿拉伯膠和50 mL水于燒杯中，溫?zé)嶂?0～80 ℃攪拌促溶，冷卻約1 h，加入20 mL甘油和30 mL飽和K2CO3水溶液，攪勻放冷，離心除去泡沫及不溶物，將清液貯于玻璃瓶中備用。

液狀石蠟。

200 mg·L-1(NH4)2SO4標準液。稱取0.094 7 g 99.5%(NH4)2SO4定容于100 mL容量瓶中。

1.4 樣品分析

堿解擴散法測試參照LY/T 1228—2015中的方法進行。

堿解蒸餾測試方法。準確稱取3.000～5.000 g過60目的土壤樣品于消化管內(nèi)，加入鋅-硫酸亞鐵還原劑1.0 g、蒸餾水20 mL、液狀石蠟1 mL，在FOSS Kjeltec 8400全自動定氮儀上加入NaOH溶液10 mL和濃度10 g·L-1硼酸-指示劑接收液30 mL，蒸餾終點體積150 mL。在滴定劑桶中加入已標定的0.1 mol·L-1鹽酸溶液，進入樣品分析欄開始對樣品進行分析。每次分析前同時作空白試驗。

根據(jù)下式計算土壤中堿解氮的含量(c，mg·kg-1)：

式中，cHCl為HCl標準液的濃度(mol·L-1)，V是樣品測定時用去HCl標準液的體積(mL)，V0是空白測定時用去HCl標準液的體積(mL)，m是土壤烘干質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaOH濃度對土壤水解性氮含量測定的影響

當NaOH濃度過低時，易水解蛋白質(zhì)水解不完全，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低；當NaOH濃度過高時，某些難水解蛋白質(zhì)發(fā)生部分水解，導(dǎo)致結(jié)果偏高[10-11]。因此，堿解蒸餾法中NaOH濃度的選擇對測定結(jié)果至關(guān)重要。采用標準物質(zhì)ASA-9(陜西黃棉土)、ASA-10(安徽潮土)對氫氧化鈉溶液濃度的選擇進行優(yōu)化。由表1可知，隨著氫氧化鈉濃度升高，土壤堿解氮含量的測定結(jié)果逐漸升高。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[12-13]。從試驗結(jié)果來看，當氫氧化鈉濃度為6 mol·L-1時，檢測結(jié)果與標準值具有很好的一致性，據(jù)此選擇氫氧化鈉濃度為6 mol·L-1。

表1 NaOH濃度對土壤水解性氮含量測定的影響

2.2 蒸餾功率對土壤水解性氮含量測定的影響

利用全自動定氮儀測定堿解氮時反應(yīng)較劇烈，管內(nèi)產(chǎn)生的大量氣泡攜帶土壤粉末，容易造成管路堵塞，因此合適的堿解功率對試驗結(jié)果至關(guān)重要。前期預(yù)試驗表明，蒸餾功率越高，管內(nèi)反應(yīng)越劇烈，當儀器蒸餾功率達到80%及以上時，管內(nèi)反應(yīng)過于劇烈，容易造成管路堵塞；而當功率小于50%時，蒸餾時間過長，反應(yīng)較緩慢，影響土壤的正常測試。由表2可知，當儀器功率為50%～70%時，土壤堿解氮含量在標準值范圍(表1)之內(nèi)，而且各功率測試值沒有顯著差異，相對標準偏差(RSD)均小于5%。試驗過程觀察發(fā)現(xiàn)，該功率下能有效防止溶液暴沸而阻塞管路。

表2 蒸餾功率對土壤水解性氮含量測定的影響

2.3 稱樣量對土壤水解性氮含量測定的影響

如表3所示，當稱樣量為3.0～5.0 g時，水解性氮含量測定結(jié)果基本一致，且RSD在0.1%～1.7%，因此建議樣品稱樣量為3～5 g。

表3 稱樣量對土壤水解性氮含量測定的影響

2.4 方法檢出限與測定下限

按照《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)的規(guī)定，滴定法的檢出限可根據(jù)滴定管所產(chǎn)生最小液滴的體積計算得到。本方法中滴定管的最小液滴為0.002 4 mL，當取樣量為3.000 0 g、標準鹽酸濃度為0.1 mol·L-1時，經(jīng)測算，方法檢出限為1.12 mg·kg-1。以4倍的檢出限作為測定下限，則該方法測試土壤水解性氮的測定下限為4.48 mg·kg-1。

2.5 方法準確度

根據(jù)上述對試驗條件的優(yōu)化，確定蒸餾法測試土壤水解性氮的參數(shù)：稱取土樣3～5 g，加1.0 g鋅-七水硫酸亞鐵混合催化劑、10 mL 6 mol·L-1NaOH溶液、20 mL H2O、1 mL液狀石蠟，儀器蒸餾功率60%，1%硼酸接收液30 mL。

2.5.1 加標回收率

對3份土樣進行硫酸銨加標回收試驗，結(jié)果如表4所示，平均加標回收率為90.3%～109.7%，說明結(jié)果符合要求。

表4 堿解蒸餾法加標回收實驗結(jié)果

2.5.2 標準樣品測定

取土壤有效態(tài)成分分析標準物質(zhì)ASA-8、ASA-9、ASA-10進行測試，每個樣品平行測定6次，計算標準偏差和RSD(表5)。采用優(yōu)化的試驗條件對標準土壤樣品進行測定的結(jié)果均合格，RSD為2.9%～3.9%。

表5 土壤標準樣品水解性氮測試結(jié)果

2.5.3 日內(nèi)和日間的重復(fù)性

取土壤有效態(tài)成分分析標準物質(zhì)ASA-8、ASA-9、ASA-10作日內(nèi)、日間重復(fù)性試驗，日內(nèi)每個樣品平行測定6次，連續(xù)測試2 d，計算標準偏差和RSD(表6)。3個標準樣品的測試值均在標準范圍之內(nèi)，且RSD為2.2%～4.5%，說明本方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

2.5.4 精密度

對6個土壤樣品分別平行測定6次，計算標準偏差和RSD(表7)，RSD均小于5%，說明本方法精密度較好。

表6 堿解蒸餾法重復(fù)性試驗結(jié)果

表7 堿解蒸餾法精密度測試結(jié)果

2.5.5 不同測定方法的結(jié)果比較

分別采用堿解擴散法與堿解蒸餾法對10個土壤樣品水解性氮含量進行測定，對2組數(shù)據(jù)作相關(guān)性分析和線性回歸(圖1)，結(jié)果顯示，兩者相關(guān)性在0.01水平顯著，說明利用FOSS Kjeltec 8400全自動定氮儀測定土壤水解性氮是可行的。

圖1 2種測試方法結(jié)果的相關(guān)性

3 討論

研究顯示，對于不同類型土壤，堿解蒸餾法和堿解擴散吸收法測定土壤中水解性氮含量具有相同的準確度[11,14-15]。但擴散吸收法操作煩瑣，檢測時間較長，測定樣品需在40 ℃恒溫烘箱內(nèi)水解24 h。同時，由于不可避免的設(shè)計缺陷，在保溫過程中容易造成擴散皿內(nèi)、外室的液體混合，極易發(fā)生相互污染，特別是在使用較高的NaOH堿液水解樣品時，易造成測定結(jié)果偏高，而如果涂抹阿拉伯膠后，毛玻璃板與擴散皿未完全密封，又會導(dǎo)致氨氣逸出，造成測定結(jié)果偏低。另外，擴散法采用手工滴定，對操作者要求較高，一定程度上存在較大的誤差。

堿解蒸餾法能很好地避免擴散法的上述問題。相比之下，凱氏定氮蒸餾法具有極為明顯的優(yōu)勢：在操作方面，較大限度地降低了人為因素對測定結(jié)果的影響，而且快捷方便，測試分析時間大大縮短，滴定時由自動電位滴定儀完成，準確性和精密性更高，容器密閉性好，受污染可能小。

本文對蒸餾條件進行了控制和改進，在保證測定結(jié)果準確的同時，大大縮短了蒸餾時間(由24 h縮短到7 min之內(nèi))，簡化操作，方法實用，可以作為一種測定土壤水解性氮的方法。操作要點如下：建議稱樣量3～5 g，堿的添加量以每次6 mol·L-1的NaOH溶液10 mL為宜，這樣既能保證易水解蛋白質(zhì)水解完全，又能控制難水解蛋白質(zhì)進行水解，確保結(jié)果的準確性；蒸餾功率建議為50%～70%，并加入分析純液狀石蠟，可以防止發(fā)泡，避免管路阻塞，并能有效抑制雜質(zhì)的產(chǎn)生。測試結(jié)果表明，堿解蒸餾法測定結(jié)果與標準值具有很好的一致性，加標回收率為90.3%～109.7%，日內(nèi)重復(fù)性和日間重復(fù)性較好，說明該方法準確性和穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性佳，可滿足規(guī)定精度的要求，更能滿足大批量土樣分析的需求。