兩個(gè)先天性軟骨發(fā)育不全家系的FGFR3基因突變研究*

謝 亮，劉瀚旻，毛 萌，代 禮

1．四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都610041)；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 兒科(成都610041)；3. 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 中國(guó)出生缺陷監(jiān)測(cè)中心(成都610041)

先天性軟骨發(fā)育不全[achondroplasia，ACH，人類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM)編號(hào) 100800]是最常見的一種侏儒類型[1-2]，估計(jì)新生兒中的發(fā)病率為1/15 000～ 1/25 000[3]。ACH是一種常染色體顯性遺傳疾病，80%病例是由于子代基因發(fā)生遺傳突變導(dǎo)致的。病人身體相應(yīng)部位軟骨的生成正常，但這些突變導(dǎo)致了軟骨發(fā)育異常且阻礙了正常成骨作用，最終導(dǎo)致長(zhǎng)骨發(fā)育異常。病人在出生時(shí)，頭部和軀干一般表現(xiàn)正常，但四肢呈現(xiàn)不成比例的短小，以近軀干型短肢(肱骨和股骨短)為典型特征，因此ACH病人表現(xiàn)為矮身材，平均身高在1.2 m左右?；颊卟弊虞^短,頭后部與頸部聯(lián)接處存在異常,這使得患者頸部的脊椎被壓縮,可能會(huì)引起睡眠呼吸暫停，這是引起ACH嬰兒突然死亡的重要原因?；颊叩拿娌勘憩F(xiàn)為前額突出，面中部發(fā)育不良，但智力未受影響。通過(guò)對(duì)ACH家系和散發(fā)病例的研究[4-7]，目前已發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)是ACH的致病基因，F(xiàn)GFR3基因位于4號(hào)染色體短臂4p16.3，其中c.1138G>A(rs28931614)是被報(bào)道最多的致病突變。本研究收集到兩個(gè)先天性軟骨發(fā)育不全家系，進(jìn)行了FGFR3基因的突變研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

知情同意下采集了兩個(gè)家系的患者及其他成員外周血液各5 mL，參與研究的有家系A(chǔ)中的Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4和Ⅲ1；家系B中的Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ2和Ⅲ1(圖1)。

圖1 兩個(gè)軟骨發(fā)育不全家系的家系圖注：A：軟骨發(fā)育不全家系A(chǔ)；B：軟骨發(fā)育不全家系B

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用全血基因組DNA提取試劑盒(bio teke corporation)提取基因組DNA。

1.2.2 PCR及序列測(cè)定 根據(jù)NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中FGFR3基因第10外顯子的序列設(shè)計(jì)引物(上游引物GCGTTACTGACTGCGAGACC，下游引物AGGCAGCTCAGAACCTGGTA)。PCR反應(yīng)總體積為50 μL，包括50 ng DNA，5 μL 10×PCR緩沖液，3 μL 25 mM MgCL2，2 μL 2.5 mM dNTP，1 μL 10 μM引物和0.25 μL TaKaRaTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min啟動(dòng)，循環(huán)條件為95 ℃變性30 s，62℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán),72 ℃后延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用ABI 3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

兩個(gè)家系的先證者(AⅢ1，女，18月齡；BⅢ1，男，21月齡)均因身材矮小就醫(yī)，經(jīng)系統(tǒng)檢查后確診為先天性軟骨發(fā)育不全。先證者具有典型的ACH臨床特征：頭圍增大，額部前突，塌鼻梁，顱面比例失調(diào)，肱骨和股骨短小，三叉手(中指和無(wú)名指間分離)，膝關(guān)節(jié)和肘關(guān)節(jié)松弛；X線檢查顯示：L1、L2和L3椎體前緣呈彈頭樣，L1-L5椎弓根距離自上而下逐漸變小，雙髂骨呈耳狀，坐骨切跡呈三叉狀變小，髖臼角變小，股骨頭未骨化，長(zhǎng)骨干骺端呈馬蹄樣改變，骨骺化骨核均未出現(xiàn)，骨齡延遲(圖2)。

圖2 ACH患者(BⅢ1)的脊椎正位X光照片

2.2 分子遺傳學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果表明，兩個(gè)家系中的病人均存在FGFR3基因G1138A突變(鳥嘌呤變?yōu)橄汆堰?，導(dǎo)致了FGFR3蛋白第380位的甘氨酸被精氨酸置換(Gly380Arg，G380R)；而在正常家系成員中沒有發(fā)現(xiàn)該突變(圖3)。

圖3 ACH患者FGFR3基因的G1138A雜合型突變和正常序列

3 討論

先天性軟骨發(fā)育不全的基本病理改變是軟骨化骨異常所致的長(zhǎng)骨縱向生長(zhǎng)受阻，但膜性化骨過(guò)程正常。FGFR3基因是目前發(fā)現(xiàn)的唯一與ACH相關(guān)的基因。由于FGFR3通過(guò)負(fù)反饋環(huán)控制軟骨細(xì)胞向骨細(xì)胞分化，而FGFR3基因的突變會(huì)導(dǎo)致其功能變強(qiáng)，進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞的分化，造成長(zhǎng)骨縱向生長(zhǎng)受阻，因而長(zhǎng)骨長(zhǎng)度減小而相對(duì)變粗，扁骨發(fā)育正常；骨骺軟骨細(xì)胞增殖后不能正常骨化，骨端增大[1-2]。自上世紀(jì)90年代中期發(fā)現(xiàn)FGFR3是ACH的致病基因后[7]，國(guó)外研究[8-10]表明,ACH的遺傳異質(zhì)性較小，97%的病例由FGFR3基因的G1138A突變(rs28931614)所致，約1%由G1138C(rs28931614)突變所致，其他突變所占的比例很小。國(guó)內(nèi)研究[11-13]表明,FGFR3基因G1138A也是中國(guó)人群常見的ACH致病性突變。本研究中的家系病例均是由FGFR3基因的G1138A突變所致，與國(guó)內(nèi)已有報(bào)道一致。

FGFR3蛋白屬于酪氨酸激酶型受體，與配體結(jié)合后形成二聚體，激活酪氨酸激酶相關(guān)的下游信號(hào)通路。敲出小鼠FGFR3基因后，其長(zhǎng)骨和脊柱生長(zhǎng)增強(qiáng)，提示FGFR3對(duì)骨生長(zhǎng)具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。G380R突變(G1138A)位于FGFR3蛋白的跨膜區(qū)域，多數(shù)學(xué)者[14-15]認(rèn)為，突變使FGFR3蛋白膜穩(wěn)定性提高，下游信號(hào)的表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，抑制了軟骨化骨過(guò)程，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。但有學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn),G380R突變沒有改變FGFR3蛋白與配體的能量狀態(tài)，提示存在其他分子病理機(jī)制。最新研究[17]顯示，發(fā)生突變的染色體僅為來(lái)自父親的染色體，因此，當(dāng)父親的年齡較大時(shí)，后代發(fā)病的幾率會(huì)升高。

本研究中，兩個(gè)家系的先證者和其母親均受累，而母親的雙親正常。推測(cè)先證者的母親為新發(fā)突變，她們將致病突變分別傳遞給了自己的子女。因此，對(duì)于有ACH家族史的孕婦，產(chǎn)前檢測(cè)其胎兒的基因型十分必要，國(guó)內(nèi)外都有產(chǎn)前診斷ACH的成功應(yīng)用[12,18]。本研究有助于進(jìn)一步了解中國(guó)漢族ACH疾病的突變譜，對(duì)疾病的產(chǎn)前篩查、診斷、遺傳咨詢和致病機(jī)制研究具有重要意義。