食品中黃曲霉毒素的污染與檢測

谷怡靜

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州 061100）

曲霉廣泛分布于空氣、土壤、谷物和各類生物中，在一定的濕度和溫度條件下，會引起食品的霉變。曲霉毒素是真菌毒素中首先發(fā)現(xiàn)的一種，文中談到的黃曲霉毒素就是曲霉毒素中最重要的一種。1960年，英國倫敦郊區(qū)發(fā)生的“火雞X病”使黃曲霉毒素首次被發(fā)現(xiàn)，其常見于谷物和糧油制品的污染。由于黃曲霉毒素具有強烈的致癌性，嚴(yán)重威脅了人類健康，所以研究食品中黃曲霉毒素的污染并對食品中黃曲霉毒素含量的檢測十分必要。

1 黃曲霉毒素的分布與結(jié)構(gòu)

1.1 黃曲霉毒素的分布

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉污染食品后滋生的一種強力毒素。這2種霉菌在自然界中普遍存在，尤其是在花生、玉米和小麥等植物性的食物中多見。黃曲霉毒素對食品的污染及污染程度因地域、季節(jié)、作物生長、儲存的條件不同而不同。在南方高溫高濕等環(huán)境中，春夏兩季黃曲霉毒素中毒頻繁發(fā)生，而華北等北方地區(qū)，除個別樣品外，一般樣品中檢測不到黃曲霉毒素。

1.2 黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)

黃曲霉毒素是具有相似結(jié)構(gòu)的多種毒素化合物的總稱，每種化合物在其基本結(jié)構(gòu)中均含有雙氫呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)?。大致可分為B類和G類，以及其在人體內(nèi)羥基化后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物M類。在這些類型中，黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最強、致癌性最強。

AFB1的分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 AFB1的分子結(jié)構(gòu)式

2 黃曲霉毒素的產(chǎn)生與理化性質(zhì)

2.1 黃曲霉毒素的產(chǎn)生

產(chǎn)生黃曲霉毒素的最適溫度11～37℃，相對濕度80%～85%，pH值在4.0以下。當(dāng)溫度處于24～30℃時，能產(chǎn)生黃曲霉毒素的最低相對濕度83%，并且在這種條件下黃曲霉菌的產(chǎn)毒量達到最高。當(dāng)霉菌處于氧氣含量充足、低溫、有微量元素的含糖量高的物質(zhì)中并且與其他霉菌競爭激烈時，黃曲霉可以在2 d內(nèi)快速生長并產(chǎn)出黃曲霉毒素。

黃曲霉毒素對農(nóng)作物的污染一般集中在其還未成熟期，即在田間生長階段。當(dāng)作物收獲后由于不良的貯藏條件或所處環(huán)境濕度較高，會導(dǎo)致霉菌爆發(fā)，從而使農(nóng)作物被毒素污染。這些霉菌廣泛存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別是以花生和核桃中最為嚴(yán)重。通常情況下，水分高于14%最適合黃曲霉的繁殖和生長。

2.2 黃曲霉毒素的理化性質(zhì)

黃曲霉毒素在適當(dāng)?shù)淖贤夤庹丈湎掳l(fā)射高強度熒光。黃曲霉毒素水溶性極差，難溶于水且?guī)缀醪蝗苡诩和?、石油醚、乙醚等溶劑。但溶于甲醇、油、丙酮、二甲基甲酰等有機溶劑中。黃曲霉毒素的熱穩(wěn)定性較好，不易受熱分解，分解溫度高達280℃，想要使其失活必須通過長時間的高溫作用（即溫度達到100～120℃后持續(xù)加熱），例如高壓消毒和煅燒。若想要進一步破壞毒素的活性，也可用NaOH萃取其中的游離脂肪酸。

3 黃曲霉毒素的殘留限量

一般來說，毒素能否對人類的身體健康造成危害取決于毒素在所食品中所占比例。黃曲霉毒素B1是到目前為止發(fā)現(xiàn)的具備最大毒性的一種真菌毒素，因此對黃曲霉毒素的許可殘留量進行了相關(guān)規(guī)定：規(guī)定大米和食用油中黃曲霉毒素的允許殘留量不得超過10μg/kg，其他食品、豆類及發(fā)酵食品中不得超過5μg/kg，嬰兒代乳食品（配方奶粉）中不得檢出黃曲霉毒素。WTO（世界衛(wèi)生組織） 給出建議：食品和飼料中黃曲霉毒素的最大殘留量不應(yīng)超過15 μg/kg。

我國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的黃曲霉毒素的允許量[1]見表1。

表1 我國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的黃曲霉毒素的允許量

4 黃曲霉毒素的危害

黃曲霉毒素為高毒性，有研究表明，其毒性相當(dāng)于砒霜（砷）的68倍，敵敵畏的100倍，會對人體和動物的肝臟、腎臟造成極大的危害，并可能使人體器官發(fā)生癌變，有很大的幾率引發(fā)腫瘤。

4.1 急性慢性中毒

黃曲霉毒素主要作用于肝臟并直接抑制DNA，RNA和肝臟蛋白質(zhì)的合成。急性中毒后會有肝出血、肝臟損傷等現(xiàn)象，并使中毒者食欲明顯減弱從而導(dǎo)致體重下降、生長緩慢，如果長時間中毒未處理則會伴隨抽搐、過度興奮等癥狀。若是由于持續(xù)攝入微量毒素而引起的慢性（亞急性） 中毒可以對動物的生長造成障礙或使肝臟出現(xiàn)慢性損傷等癥狀。

4.2 致癌性

黃曲霉毒素可誘發(fā)肝癌的發(fā)生。其誘發(fā)肝癌是通過人體長期攝入少量或短期攝入大量毒素造成的。其中以AFB1的致癌能力最強，AFG1和AFM1次之。王慶峰等人[2]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙型肝炎病毒的攜帶者或大部分吸煙者發(fā)生黃曲霉毒素中毒時，這2種疾?。ú《九c毒素）會發(fā)生協(xié)同作用，使肝癌的發(fā)生率明顯增高。

4.3 其他毒性

在其他毒性中，以胚胎毒性最為嚴(yán)重。當(dāng)黃曲霉毒素對肝臟造成直接傷害后，可導(dǎo)致遺傳基因畸變，致畸胎或死胎。

5 黃曲霉毒素的檢測方法

近幾年來，隨著黃曲霉毒素研究方法的不斷完善，檢測技術(shù)的靈敏度與檢測結(jié)果的精密度不斷提高，出現(xiàn)了許多快速檢測方法。主要有薄層色譜分析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、免疫化學(xué)分析法和生物傳感器技術(shù)。這些新方法和新技術(shù)的廣泛應(yīng)用與發(fā)展使得人們在檢測黃曲霉毒素方面有了更多的選擇。針對檢測的不同目的與要求可以更好地選擇所適用的技術(shù)。

5.1 薄層色譜分析法（TLC）

目前，國內(nèi)大部分檢測機構(gòu)都采用薄層色譜法檢測黃曲霉毒素，這也是國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法。唐志峰等人[3]認(rèn)為這種方法是依據(jù)分子分離的方式檢測的，主要是利用儀器作為基礎(chǔ)設(shè)備進行掃描，以獲取其中的黃曲霉毒素含量，這是基于傳統(tǒng)視覺檢測方法不斷改進和創(chuàng)新的結(jié)果。其基本原理是用適當(dāng)?shù)妮腿臉悠分休腿〕鯝FB1，濃縮、純化并在薄層板（色譜）上展開層析、分離，接著在紫外光下激發(fā)顯色，利用AFT的熒光性進行定量判斷。根據(jù)樣品在紫外光下的熒光點的強度，與標(biāo)準(zhǔn)品的熒光點相比，以此來確定黃曲霉毒素在樣品中的含量是否超標(biāo)，為半定量分析方法。這種分析方法的優(yōu)點是所需設(shè)備簡單、操作方便，一般的檢測實驗室即可完成測定。缺點是樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣、費時費力、測定的干擾因素多，所得結(jié)果的準(zhǔn)確性差、誤差較大。最重要的一點是該方法的最低檢出限為5μg/kg，與國標(biāo)上的毒性安全劑量0.01μg/kg[4]相比所需試劑量過多，所以這種檢測方法會間接對操作人員的身體造成傷害，已經(jīng)逐漸被其他方法替代。

5.2 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜（HPLC）是一種利用液體作為流動相的新型液相色譜檢測技術(shù)。該方法已被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外黃曲霉毒素的檢測中。步驟一般分為提取、凈化和檢測。其原理是樣品經(jīng)凈化后，在適當(dāng)?shù)牧鲃酉嘞?，使用反相C18色譜柱，根據(jù)分離組分在流動相和固定相中的溶解度不同而將樣品中的AFT分離出來，達到分離目的。根據(jù)分離情況的不同可形成一定的色譜峰，通過測量色譜峰的面積從而做到對AFT的定量分析[5]。李紅梅等人[6]通過加入標(biāo)液從而得到峰面積與濃度的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并發(fā)現(xiàn)AFB1在5～100 ng/mL線性關(guān)系比較穩(wěn)定，如果信噪比3為標(biāo)準(zhǔn)，則HPLC對AFB1的檢出限為1 ng/mL。趙群等人[7]利用此方法測定玉米中的黃曲霉毒素時，發(fā)現(xiàn)樣品中峰全部出完僅需5 min，耗時非常短并且測出當(dāng)加標(biāo)測定玉米中的黃曲霉毒素時，玉米樣品加標(biāo)回收率可達到93.9%～104.4%。孟之航等人[8]更是由此方法檢測了20多種堅果，其中都未發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素，而玉米被黃曲霉毒素污染的程度高達36%。高效液相色譜法檢測結(jié)果誤差小、靈敏度高、操作方便、數(shù)據(jù)可靠，但是儀器、試劑比較昂貴?，F(xiàn)在人們正在不斷的研究此方法，使這個方法可以運用更加廣泛。

TLC與HPLC 2種方法的比較[9]見表2。

表2 TLC與HPLC 2種方法的比較

5.3 免疫化學(xué)分析法

5.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA） 是基于20世紀(jì)70年代開發(fā)的免疫學(xué)和細胞工程學(xué)的微觀檢測技術(shù)。其原理是抗體吸附在固相載體上以形成酶反應(yīng)板的孔。然后將酶標(biāo)記的抗原和樣品混合物加入酶反應(yīng)板的孔中，引起特定的免疫反應(yīng)以形成具有酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物。最后，將這種酶的底物加入小孔中進行顯色反應(yīng)。比較顯色反應(yīng)完成后樣品出現(xiàn)的顏色與標(biāo)準(zhǔn)品的顏色的深淺，從而判斷出樣品中待測物（即黃曲霉毒素）的含量[10]。ELISA及其試劑盒可用于定性和定量的檢測。Liu D等人[11]用ELISA檢測試劑盒檢測了生牛奶中黃曲霉毒素的含量并對試劑盒的原理與檢測結(jié)果進行了更完整的描述和說明。該方法靈敏度高、費時短、特異性較強、不用接觸有毒樣品，最低檢出限為0.02μg/kg[12]。不過也有缺點，此方法所用的酶容易受外界條件的影響，外界條件的改變可能會使檢測的結(jié)果不準(zhǔn)確，而且如果對樣品的前處理不適當(dāng)，容易出現(xiàn)假陽性或陰性結(jié)果，同時ELISA試劑也需要低溫保藏否則會影響檢測結(jié)果。

5.3.2 放射免疫分析法（RIA）

放射免疫分析法與酶聯(lián)免疫吸附法的原理基本相同，不同的是RIA所用的標(biāo)記物為放射性元素而ELISA所用的標(biāo)記物是酶。放射免疫分析法的檢測結(jié)果具有高度特異性和靈敏性、儀器檢測快速精確、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化。但由于其標(biāo)記物是放射性元素，所以長時間使用此方法檢測會對接觸到放射性元素的人們身體健康造成極大危害，目前這種方法也逐漸被其他更好的方法所替代，不再廣泛應(yīng)用。5.3.3 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析技術(shù)（Immune colloidal gold technique）是基于抗原和抗體特異性結(jié)合的一種快速檢測的固相膜免疫分析技術(shù)。其原理是樣品中游離的抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合。如果樣品中沒有待測抗原，則游離金標(biāo)抗體將與固定在膜上的半抗原特異性結(jié)合形成紅色帶，測試結(jié)果為陰性；如果含有待測抗原，則游離抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合，其可抑制固定在膜上的半抗原與金標(biāo)抗體的結(jié)合。隨著樣品中待測抗原含量的升高，所形成的紅色條帶變淺，樣品中待測抗原的含量與條帶顏色的深淺成反比，檢測結(jié)果呈陽性。由于該方法操作簡便、所需檢測時間短、靈敏度高，所以常應(yīng)用于大批量樣品的快速現(xiàn)場檢測和實驗室樣品的初步篩選，具有可觀的發(fā)展前景。目前，已經(jīng)研發(fā)出了一種用于快速定量檢測黃曲霉毒素的膠體金檢測試劑盒。宋青龍等人[13]用膠體金快速檢測試劑盒檢測了玉米中黃曲霉毒素的含量，并分析了試劑盒檢測方法，利用試劑盒檢測不同濃度的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)結(jié)果的特異性發(fā)現(xiàn)了每種檢測到的毒素含量均小于2μg/kg，證明了檢測黃曲霉毒素的試劑盒與玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）等均不出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

5.3.4 金標(biāo)免疫層析法（GICA）

金標(biāo)免疫層析技術(shù)（Gold labeled immunochromatographic assay，GICA） 也被人們稱為金標(biāo)試紙法，它是基于膠體金免疫層析技術(shù)開發(fā)的單克隆抗體設(shè)計的固相免疫分析方法。使用納米金作為標(biāo)記物可以在短時間內(nèi)測定樣品中的AFT含量，并且可以得到直觀、準(zhǔn)確的結(jié)果。該方法不需要分離結(jié)合標(biāo)記物與自由標(biāo)記物，從而省去了許多繁瑣的預(yù)處理步驟。趙曉聯(lián)等人[14]對此方法進行了一定的分析，利用不同質(zhì)量濃度的黃曲霉毒素的標(biāo)液測定出金標(biāo)試紙的最低檢出限為2.5 ng/mL，并指出金標(biāo)試紙在37℃條件下可保存7 d，4℃條件下可保存10個月左右。結(jié)果的重復(fù)性好，AFB1單克隆抗體與AFB2，AFG2交叉反應(yīng)率分別為7.14%和6.25%，交叉率較低。金標(biāo)試紙法的靈敏度高，不需要儀器設(shè)備之間復(fù)雜的相互配合，檢測亦可隨時隨地進行。孫秀蘭等人[15]提出鹽、重金屬離子和油脂對金標(biāo)試紙檢測影響較大，其中重金屬的影響程度為Fe3+＞Cu2+＞Pb2+＞As3+，而對于一些含鹽較高的物質(zhì)為了使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確，一般在檢測前先進行脫鹽處理。該方法定性檢測黃曲霉毒素的準(zhǔn)確度超過85%，靈敏度為4 ng/mL。此外，樣品中黃曲霉毒素的檢出限可達到20 ng/g[16]。當(dāng)下，隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展進步，金標(biāo)試紙法漸漸被人們接受并廣泛應(yīng)用。

5.3.5 免疫親和柱-熒光分光光度法

熒光分光光度法原理是以免疫親和柱作為分離手段，將樣品通入免疫親和柱，樣品中的AFT可在免疫親和柱的作用下進行凈化、富集。免疫親和柱將高選擇性地選擇吸附樣品中的AFT并讓其他雜質(zhì)通過，然后用極性有機溶劑洗脫下來被吸附的AFT，即可進行定量檢測。將洗脫的凈化液與碘液或溴水進行反應(yīng)，使AFB1和AFG1衍生成具有高熒光活性的穩(wěn)定的物質(zhì)，然后利用熒光光度計，在一定條件下即可測出樣品中AFT含量。這樣檢測出的結(jié)果精密度較高，平均回收率較好，但其所用到的儀器價格都比較昂貴、操作有些繁瑣，所以在實驗室中不經(jīng)常使用此方法。

5.4 生物傳感器

生物傳感器是基于生物技術(shù)和電子技術(shù)的復(fù)雜儀器，使用生物組件作為傳感器的主要功能元件。包括4個部分：即生物識別元件、轉(zhuǎn)換元件、機械元件和電氣元件組成。檢測的原理是使待測樣品中的抗原（即黃曲霉毒素） 與由抗體（或抗原） 與轉(zhuǎn)換器構(gòu)成的傳感器上的生物識別元件的特異性抗體反應(yīng)，以形成抗原抗體的特異性結(jié)合物，結(jié)合物的量的多少可由轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成不同強度的電信號，根據(jù)電信號的強弱變化，可檢測出樣品中黃曲霉毒素的含量。林海等人[17]進行了一系列研究后提出這種生物傳感器的專一性較強，只能與特定的底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后傳出信號，不會受到樣品內(nèi)在因素的干擾（如樣品的顏色、濁度等），分析速度快、精度高，誤差可減小到1%。王亞楠等人[18]提出生物傳感器檢測AFT的LOD為0.25μg/kg，范圍為0.25～4.0μg/kg。目前，生物傳感器測定AFT的方法還不夠成熟，難以實現(xiàn)大批量的檢測，需要進一步的完善。

6 黃曲霉毒素的預(yù)防與控制

黃曲霉毒素具有很強的熱穩(wěn)定性，巴氏消毒也不能徹底殺滅黃曲霉毒素。Cui X等人[19]通過試驗驗證了這一結(jié)論，測出AFT在雞（動物）體內(nèi)主要沉積在肝臟與腎臟，在食用前加熱也不易去除，并且指出沉積在動物體內(nèi)的這些毒素會隨食物鏈進入人體內(nèi)，人類通過長時間的攝入即可引起慢性毒性，對人們的健康會造成損害。

一般的安全防控措施包括：將花生、大豆、稻谷、小麥等在貯藏前應(yīng)迅速降至其水分含量達8%～13%或以下，并貯藏于干燥的地方（相對濕度75%以及室溫10℃以下）；貯藏期間注意通風(fēng)防潮；降低食物表面環(huán)境的氧氣濃度；加強糧食，大豆等糧油農(nóng)產(chǎn)品的貯藏和銷售和售前檢驗；化學(xué)方法防霉，加入一些防霉劑（如溴甲烷，二氯乙烷）；豆類、谷類應(yīng)洗凈后烹煮；挑選出霉變的糧食顆粒（加堿淘洗再搓洗）；適當(dāng)?shù)奶砑右恍A性物質(zhì)，或者用紫外光照射進行去毒。

7 結(jié)語

黃曲霉素會對人體健康造成非常嚴(yán)重的危害。因此，黃曲霉毒素的檢測方法和限量必須得到更多關(guān)注和發(fā)展，中國還應(yīng)制定更為嚴(yán)格的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷進步，特別是在免疫學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)方面的不斷發(fā)展，已經(jīng)研發(fā)建立起了許多既快速又簡便，同時特異性強、靈敏度高的檢測方法。但是，現(xiàn)有的AFT檢測方法有利有弊，所以在測定AFT含量時可結(jié)合多種方法進行測定，得出最為準(zhǔn)確明了的數(shù)據(jù)。