植物乳桿菌DMDL9010凍干優(yōu)化研究

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣州510640；2.廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣州510640）

0 引言

隨著研究人員對乳酸菌的不斷研究，乳酸菌類產(chǎn)品的應用越來越廣泛[1]。植物乳桿菌作為白菜、甘藍、黃瓜等蔬菜發(fā)酵的主要微生物之一[2]，具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、控制體質(zhì)量等益生保健功效[3]。目前，乳酸菌制劑采用真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等不同的方法進行制備[4-8]，其中冷凍干燥是生產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵劑常使用的工藝，但是凍干過程中會導致細胞活力降低。陳濤等[9]研究發(fā)現(xiàn)在凍干過程中影響菌粉存活率的因素有很多，研究如何提高存活率具有重要意義[10-11]。

筆者課題組前期從泡菜水中篩選出得到具有較好的降膽固醇效果的植物乳桿菌DMDL9010(Lactobacillus plantarum DMDL9010)，對其離心條件和凍干保護劑進行優(yōu)化，以期為提高菌粉凍干存活率及開發(fā)商品化蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌劑提供理論基礎(chǔ)。

1.1 菌種、培養(yǎng)基和保護劑

植物乳桿菌 DMDL9010（Lactobacillus plantarum DMDL9010），由華南理工大學食品科學與工程學院食品質(zhì)量與安全系篩選分離并保存。

MRS培養(yǎng)基，在 0.10-0.15 MPa，121℃滅菌 15 min；脫脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘氨酸、可溶性淀粉、抗壞血酸、硫酸錳均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機（SCIENTZ-18N），高速離心機（JW-3021HR），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-18SI）。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將植物乳桿菌DMDL9010按照體積分數(shù)為3%的接種量，接種至基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基中，活化菌株。

1.4.2 離心條件的優(yōu)化

在離心轉(zhuǎn)速分別為4 000，6 000，8 000，10 000 r/min、的條件下，將活化好的菌懸液，分別進行10，20，30 min

1 實 驗

離心，收集上清液與菌泥，稀釋平板計數(shù)[12]，比較在不同參數(shù)下菌株的離心存活率[13]。

1.4.3 單一保護劑的篩選

選取脫脂乳粉（質(zhì)量分數(shù)，下同，3%，6%，9%，12%，15%），葡萄糖（2%，4%，6%，8%，10%），細菌學蛋白胨（2%，4%，6%，8%，10%），可溶性淀粉（10%，12%，14%，16%，18%，20%），甘氨酸（3%，6%，9%，12%），甘油（1.0%，1.2%，1.4%，1.6%，1.8%，2.0%），海藻糖（10%，12%，14%，16%，18%）作為單一凍干保護劑，以單體菌粉活菌數(shù)（g-1）[14]為依據(jù)，研究其在凍干過程中對植物乳桿菌DMDL9010的保護效果。其中，菌泥與配制的凍干保護劑溶液體積為1∶3。

1.4.4 Box-Behnken 優(yōu)化實驗設(shè)計

將單因素篩選出的保護效果較好的凍干保護劑脫脂乳粉、海藻糖和細菌學蛋白胨做為實驗因素，以植物乳桿菌粉活菌數(shù)為響應值，設(shè)計Box-Behnken響應面分析實驗。采用Design Expert 8.0.5軟件輔助實驗，實驗因素水平及編碼見表1，實驗設(shè)計及結(jié)果見表4。并重復優(yōu)化實驗保護劑組合，對實驗結(jié)果進行驗證。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平 %

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Design Expert 8.0軟件完成響應面設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、回歸模型建立，Origin Pro 8.0進行作圖。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。每組實驗測定3個數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用M±SD表示。

2 結(jié)果分析

2.1 離心條件的優(yōu)化分析

表2 離心實驗結(jié)果

由表2可以看出，相同離心時間下，隨轉(zhuǎn)速的升高，上清液活菌數(shù)顯著降低，菌泥活菌數(shù)先升高后降低，且在轉(zhuǎn)速為8 000 r/min時達到最大活菌數(shù)，這表明過低的離心轉(zhuǎn)速使得菌體無法充分沉淀，獲得菌泥量少，而過高的離心轉(zhuǎn)速雖能有效使菌體沉淀，但對活菌機械損傷程度大，大量活菌在離心過程中受到損傷、死亡。相同轉(zhuǎn)速下，隨離心時間的延長，上清液活菌數(shù)明顯降低，菌泥活菌數(shù)明顯增加，且在離心30 min時活菌數(shù)達到最大，表明足夠的離心時間可以使活菌充分沉淀。但離心時間不宜過長，過長的離心時間會使效率降低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。這與王大欣[15]等的研究結(jié)果一致，在保證較高的活菌數(shù)量的前提前選擇最優(yōu)的離心條件。

選取8 000 r/min（30 min）的離心參數(shù)，以保證最佳的離心存活率，此時菌泥活菌數(shù)可達最大值31.35×108mL-1。

2.2 單一凍干保護劑篩選

表3 不同凍干保護劑對植物乳桿菌DMDL9010的影響 g-1

由表3可知，當菌泥中加入6.0%的脫脂乳粉時，凍干后菌株存活率可達43.16%，與楊加懷[16]的研究結(jié)果一致，脫脂乳粉對植物乳桿菌DMDL9010具有顯著的保護作用。脫脂乳粉是良好的有機氮源、碳源，且脫脂乳粉中含有的乳清蛋白在冷凍干燥的過程中對植物乳桿菌DMDL9010有一定的保護作用[17-18]。

當葡萄糖質(zhì)量分數(shù)低于8.0%時，隨著葡萄糖質(zhì)量分數(shù)的增加，凍干后菌株存活率明顯提高，高于8.0%時，存活率顯著降低，即當菌泥中加入8.0%葡萄糖時，凍干后菌株存活率可達到最大16.14%。葡萄糖可以促進細胞在懸浮液中分散，還可以作為細胞今后生長用的碳源[19]。但與其他的備選保護劑相比，葡萄糖對植物乳桿菌DMDL9010的保護作用要低于脫脂乳粉、海藻糖和細菌學蛋白胨，這與張英華等[17]的研究一致。

細菌學蛋白胨質(zhì)量分數(shù)為8.0%時，菌株存活率最高30.24%，但細菌學蛋白胨質(zhì)量分數(shù)低于或高于8.0%時，存活率顯著降低，且保護劑含量增高易出現(xiàn)凍干不徹底現(xiàn)象，影響凍干菌粉的品質(zhì)。

在一定的質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)，隨著可溶性淀粉質(zhì)量分數(shù)的增加，凍干后菌株存活率提高。但可溶性淀粉質(zhì)量分數(shù)高于16.0%時，存活率呈明顯下降的趨勢，即當菌泥中加入16.0%的可溶性淀粉時，存活率最高僅為4.75%。這與張澤生等[18]的研究一致，加入可溶性淀粉后，植物乳桿菌的存活率較低。

甘氨酸對于植物乳桿菌DMDL9010的保護作用比較有限。隨著甘氨酸質(zhì)量分數(shù)的增加，凍干后菌株存活率顯著降低。甘氨酸的在生理鹽水中的溶解度較低，且與其他備選保護劑相比，所凍干后活菌數(shù)較低，獲得甘氨酸的成本較高，工業(yè)上的應用可行性不足，因此，不宜選擇甘氨酸作為后續(xù)優(yōu)化的凍干保護劑。

甘油質(zhì)量分數(shù)為1.8%時，凍干后菌株存活率最高3.64%。甘油屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的黏度增加，從而弱化了水的結(jié)晶過程，減輕了細胞外溶質(zhì)質(zhì)量分數(shù)升高所造成的細胞損傷。同時，甘油進入細胞后，使細胞內(nèi)溶質(zhì)質(zhì)量分數(shù)升高，細胞內(nèi)壓力接近于細胞外壓力，減少了細胞脫水的程度和速度[20]。當甘油質(zhì)量分數(shù)達到2.0%以上時不易凍干，所制成的菌粉較黏稠，無法研磨成粉末狀。

海藻糖具有抗凍抗熱的穩(wěn)定性。海藻糖不僅可以通過與細胞外水分子形成氫鍵來提高細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[21]，而且它具有較高的晶體轉(zhuǎn)換溫度，可以在較高的凍干溫度下保持很好的穩(wěn)定性[22]。，當菌泥中加入14.0%海藻糖時，凍干后菌株存活率最高，達28.68%。這與王大欣[15]等的研究結(jié)果相一致，在眾多的保護劑中，海藻糖保護效果顯著。

綜上所述，添加脫脂乳粉6.0%，細菌學蛋白胨8.0%，海藻糖14.0%時菌株存活率最高，對植物乳桿菌DMDL9010凍干的保護效果較好。這與張英華等[17]的研究一致，張英華等的實驗結(jié)果表明，脫脂乳粉、細菌學蛋白胨、海藻糖對乳酸菌的保護作用要優(yōu)于其他凍干保護劑。

2.3 Box-Behnken實驗結(jié)果

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以植物乳桿菌粉活菌數(shù)為單一指標，選擇脫脂乳粉、海藻糖和細菌學蛋白胨作為3個實驗因素做Box-Behnken設(shè)計，設(shè)計及結(jié)果如表4所示。

表4 Box-Behnken設(shè)計及結(jié)果

利用DesignExpert8.0軟件對上述數(shù)據(jù)進行分析，得回歸模型方差分析，結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken回歸模型的方差分析結(jié)果

對表5回歸模型方差分析，實驗所選用模型P值0.0002＜0.05，決定系數(shù)R2=0.9696，說明模型與實際情況擬合良好。根據(jù)以上分析得知活菌數(shù)Y對自變量脫脂乳粉（A）、細菌學蛋白胨（B）、海藻糖（C）的多元回歸方程：

該方程表達了植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)和3個自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，同時實驗方法也是可靠的?；貧w方程的一次項系數(shù)比較大，交互項系數(shù)中BC的交互系數(shù)比較大，說明細菌學蛋白胨和海藻糖之間的交互效應大，而AB、AC的交互系數(shù)比較小，說明脫脂乳粉和細菌學蛋白胨、脫脂乳粉和海藻糖之間的交互效應小。

為了檢驗方程的有效性，對測定的植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)的數(shù)學模型進行方差分析，并對各因子的偏回歸系數(shù)進行檢測。一次項中A的回歸系數(shù)高度顯著，P＜0.0001說明脫脂乳粉質(zhì)量分數(shù)對植物乳桿菌DMDL9010生長有高度顯著作用。C的回歸系數(shù)僅次于A，說明不同質(zhì)量分數(shù)對植物乳桿菌DMDL9010生長影響僅次于脫脂乳粉。交互項BC回歸系數(shù)較其他因素顯著，說明細菌學蛋白胨和海藻糖之間的交互項對植物乳桿菌DMDL9010的生長較為顯著。擬合度R2=0.9696，說明該方程對實驗擬合度良好。

根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應面分析圖及等高線圖（圖1），分析脫脂乳粉（A）、細菌學蛋白胨（B）、海藻糖（C）的不同質(zhì)量分數(shù)組合對凍干后植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)的影響。

圖1 Box-Behnken優(yōu)化實驗擬合響應曲面交互作用影響

為了得到植物乳桿菌DMDL9010菌粉最大活菌數(shù)，培養(yǎng)基中脫脂乳粉和海藻糖水平需要比例適宜。由圖1和方差分析可知，對植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)的影響順序為BC＞AB＞AC。

對二次回歸方程求一階偏導，當響應值Y（凍干菌粉活菌數(shù)）最大值時各因子水平為脫脂乳粉（A）12.00%、細菌學蛋白胨（B）7.95%、海藻糖（C）15.20%。此時理論預測植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)為4.195×108g-1，其中凍干存活率達13.38%。

2.4 驗證實驗

為驗證Box-Behnken實驗結(jié)果的可靠性，重復優(yōu)化實驗凍干保護劑組合（脫脂乳粉12.00%，細菌學蛋白胨7.95%，海藻糖15.20%）。結(jié)果表明，植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)可達3.78×108g-1，與理論預測值相吻合。

3 結(jié) 論

本文探究了植物乳桿菌DMDL9010凍干優(yōu)化的方法，應用離心法收集菌泥，探究不同離心速率及時間對菌體活菌率的影響，最終確定了最佳離心條件為8 000r/min（30 min），此時菌泥活菌數(shù)可達最大值3.135×108mL-1，但離心轉(zhuǎn)速與時間參數(shù)過大，有待于進一步探討；通過單因素篩選和響應面優(yōu)化，實驗數(shù)據(jù)得到的二次響應曲面模型具有較高的回歸率，與實驗結(jié)果吻合程度較高，確定了脫脂乳粉12.0%，細菌學蛋白胨7.95%，海藻糖15.2%時為最佳保護劑配方，此時理論預測植物乳桿菌DMDL9010菌粉活菌數(shù)為 4.195×108g-1，進一步進行驗證試驗，測得實際菌體數(shù)為3.78×108g-1，即凍干后菌體活力高，凍干存活率達13.38%，為開發(fā)商品化蔬菜發(fā)酵專用乳酸菌劑提供理論基礎(chǔ)。此凍干保護劑配方成分簡單，價格低廉，可為其他微生物或動植物細胞保護提供參考。