生鮮牛乳中三種β-內(nèi)酰胺酶檢測方法的比較

張磊，王利剛，付莎莉，吳丹，陳欣，蘇敏，黃思瑜，楊小珊

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶401121）

0 引言

在奶牛飼養(yǎng)中使用β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素可導(dǎo)致生產(chǎn)的生鮮牛乳中含有抗生素殘留，國際和國內(nèi)均規(guī)定生鮮乳中抗生素“不得檢出”[1]。2009年，全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治領(lǐng)導(dǎo)小組發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單(第二批)》，將β-內(nèi)酰胺酶（金玉蘭酶制劑）列入乳與乳制品中可能違法添加的非食用物質(zhì)，生鮮牛乳中添加β-內(nèi)酰胺酶的現(xiàn)象得以改善[2]，但仍有生鮮乳中檢出β-內(nèi)酰胺酶的報道[3-8]。

目前，檢驗中用到的β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法有碘量法[9]、酸度法[10]、高效液相色譜法[11]、免疫法[12]、微生物法（杯碟法）等[13]。本研究將杯碟法、碘量法和基于免疫法的快速檢測條法三種實驗室常用檢驗方法進行了比較和討論，為實驗室β-內(nèi)酰胺酶的檢驗工作提供參考。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，牛津杯，麥?zhǔn)媳葷醿x，Charm ROSA 56C孵育器，Charm ROSA讀數(shù)儀。

藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，營養(yǎng)瓊脂，抗生素檢測用培養(yǎng)基Ⅱ，Charm MRLβ-內(nèi)酰胺酶快速檢測條，濃度為0.1 mol/L碘標(biāo)液，脫脂奶粉。

青霉素標(biāo)準(zhǔn)品，β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)品，舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 試劑配制

磷酸鹽緩沖溶液（pH=6.0）：無水KH2PO4為8.0 g，無水K2HPO4為2.0 g，蒸餾水加至1 000 mL，121℃滅菌15 min。

青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取適量青霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液：量取β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取適量舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?，不可反?fù)凍融使用。

脫脂牛奶：稱取適量脫脂奶粉，用蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的脫脂牛奶。

1%淀粉指示液：取可溶性淀粉1 g，加水5 mL攪勻后，調(diào)成糊狀，再加蒸餾水80 mL，加熱，使其溶解，最后用蒸餾水稀釋至100 mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 方法

1.3.1 杯碟法

按照《關(guān)于印發(fā)全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導(dǎo)原則和方案的通知(食品整治辦[2009]29號)》附件3中指定檢驗方法《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗方法-杯碟法》進行檢驗。

1.3.2 碘量法

取1 mL脫脂牛奶于試管中，依次加入1 mL100、80、60、50、40、30、20 U/mLβ-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，在37℃水浴中恒溫振蕩40 min，加入1%淀粉溶液50μL，再加入濃度為0.1 mol/L碘標(biāo)液20μL，不斷振蕩，于2 min內(nèi)觀察顏色變化情況。

1.3.3 快速檢測法

取出一片陽性質(zhì)控藥片到質(zhì)控物配制管中，再加入1 mL的蒸餾水或陰性牛奶，充分混勻配成陽性質(zhì)控溶液。調(diào)節(jié)孵育器溫度至56℃。取陽性質(zhì)控溶液50μL到離心管中，再加入375μL待檢測樣品充分混勻，靜置40 min，配成待檢溶液。取出檢測條，水平放置在孵育器上，小心揭開黏膜至指示線處。用移液器取300μL已配好的待檢溶液，緩慢豎直滴加至檢測條的凹槽中。將貼膜重新封好，蓋上孵育器塑料蓋，自動開始倒計時。孵育8分鐘結(jié)束后，蜂鳴器響動，取出檢測條，3 min內(nèi)判讀結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 杯碟法

根據(jù)《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗方法-杯碟法》中結(jié)果報告部分進行判定，判定前應(yīng)首先確定純水的抑菌系統(tǒng)成立，然后根據(jù)系統(tǒng)不同添加物的抑制圈的大小差異進行判定。實驗結(jié)果如表1所示。

表1 杯碟法靈敏度實驗結(jié)果

該方法采用的標(biāo)準(zhǔn)菌株藤黃微球菌對青霉素類藥物絕對敏感，舒巴坦可特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，青霉素作為底物，通過比對樣品添加與不添加β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（舒巴坦）所產(chǎn)生的抑制圈的大小來間接測定樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。根據(jù)實驗結(jié)果，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在4 U/mL時，能夠判定檢出，故該方法的檢出限為4 U/mL，與方法限定相符。

杯碟法的實驗操作較為繁瑣，包括以下多個步驟，菌懸液制備、樣品制備、檢驗平板制備、放置牛津杯、檢樣分組處理、加樣培養(yǎng)、測量抑菌圈等，要求操作者具有較高的實驗技術(shù)和豐富的經(jīng)驗。該方法的檢出限靈敏，為β-內(nèi)酰胺酶檢驗的制定方法，故針對其實驗條件進行優(yōu)化的研究較多，為該方法的實施積累了經(jīng)驗[14-15]

，有研究給出了青霉素G和舒巴坦的最佳使用質(zhì)量濃度，并指出不同廠家的β-內(nèi)酰胺酶的檢測限不同，以此為基礎(chǔ)對杯碟法進行了優(yōu)化[16]。有研究針對指示菌的濃度和培養(yǎng)時間等對實驗結(jié)果的影響提出了優(yōu)化方案[17]。

2.2 碘量法

添加淀粉溶液和碘標(biāo)液后，在2 min內(nèi)能進行判定。2 min內(nèi)使藍色完全消退的為陽性，不消退者為陰性，即白色表示含有β-內(nèi)酰胺酶，藍色為不含β-內(nèi)酰胺酶。實驗結(jié)果如表2所示。

表2 碘量法靈敏度實驗結(jié)果

β-內(nèi)酰胺酶的親核基團可將青霉素開環(huán)形成青霉酸，隨后脫羧重排生成青霉噻唑酸(benzylpenicilloic acid，BPA)，青霉噻唑酸可與淀粉競爭性結(jié)合游離碘，從而破壞碘與淀粉生成的藍色復(fù)合物，使藍色變?yōu)闊o色。根據(jù)實驗結(jié)果，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在25 U/mL時，出現(xiàn)部分褪色的情況，說明此條件下β-內(nèi)酰胺酶催化青霉素的產(chǎn)物不足以完全結(jié)合碘，不能定性；當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在30 U/mL時，可在2 min時間內(nèi)完全褪色，滿足定性判斷要求，因此，認(rèn)定該方法的檢測限為30 U/mL。

該方法的操作簡單但是也存在較多制約因素：（1）實驗要求2 min內(nèi)進行判讀，原因分析如下：第一，碘和淀粉形成的碘-淀粉包合物不穩(wěn)定，容易分解出現(xiàn)褪色；第二、淀粉分子末端的醛基會被碘氧化，也會造成褪色。（2）牛乳中含有的脂肪也會與碘發(fā)生反應(yīng)，可通過離心或者甲醇提取等方法去除牛乳中的脂肪。（3）牛乳本身為乳白色不利于褪色反應(yīng)的觀察，因此除整組實驗需設(shè)置空白對照、陰性對照、陽性對照外，每組檢樣可設(shè)置陰性對照，以便對比觀察反應(yīng)結(jié)果。

2.3 快速檢測法

孵育器中取出后3 min內(nèi)進行判定，如果檢測線的顏色和控制線的顏色一致或者比控制線顏色深，則判斷樣品為陽性。如果檢測線的顏色不可見或者比控制線顏色淺時，則判斷樣品為陰性。也可使用讀數(shù)儀進行判定，當(dāng)讀數(shù)儀讀數(shù)結(jié)果為小于等于+500時可以判定為β-內(nèi)酰胺酶陽性，當(dāng)大于+500時判定為β-內(nèi)酰胺酶陰性。實驗結(jié)果見表3。

該方法為一種免疫分析方法，基于極低濃度的β-內(nèi)酰胺酶便可催化水解一定濃度的青霉素G，然后通過配體-受體識別法快速檢測與反應(yīng)后殘留的青霉素的含量，間接檢測樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。根據(jù)實驗結(jié)果，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶濃度在4 U/mL時，肉眼無法判讀，但讀數(shù)儀讀數(shù)結(jié)果均高于500，判定檢出。因此，認(rèn)定該方法的檢測限為4 U/mL。

表3 快速檢測條靈敏度實驗結(jié)果

該方法檢驗過程包括以下3個關(guān)鍵點：（1）將質(zhì)控物和待檢測牛奶樣品混合；（2）β-內(nèi)酰胺酶和質(zhì)控物青霉素G快速反應(yīng)；（3）在56℃孵育8 min過程中，在測試條的檢測線（T線）處可以檢測到剩余的青霉素。如牛奶樣品中有β-內(nèi)酰胺酶，測試條的檢測線（T線）區(qū)會出現(xiàn)紅色條帶，而控制線（C線）區(qū)會出現(xiàn)淺紅色的條帶。如牛奶樣品中沒有摻雜β-內(nèi)酰胺酶，或者β-內(nèi)酰胺酶的量少于可檢測到的范圍，在測試條上控制線（C線）區(qū)有出現(xiàn)紅色條帶，檢測線（T線）區(qū)會出現(xiàn)淺紅色的條帶。此外，在檢驗中會出現(xiàn)檢樣中乳脂或蛋白含量很高，導(dǎo)致檢測條的質(zhì)控線（C線）不現(xiàn)色，可離心后除去脂肪、蛋白層后進行檢測。

3 結(jié)論

綜合3種方法的檢驗原理、所需設(shè)備等方面進行比較，簡要的比較情況如表4所示。

表4 3種方法的綜合比較

由表4可以看出，杯碟法作為國家推薦方法，在靈敏度上具有很好的優(yōu)勢，但是該方法實際操作中需要大量的準(zhǔn)備工作，操作過程繁瑣，從準(zhǔn)備試驗到判定結(jié)果，需要2～3 d才能完成，同時對實驗操作人員的經(jīng)驗和操作能力有著極強的要求。碘量法相對快速，操作簡單，實驗成本較低，但是其靈敏度難以達到要求?？焖贆z測法操作簡單，速度快，且靈敏度高，但其成本相對較高。因此，在實驗條件相對落后的奶站等從業(yè)機構(gòu)進行自檢時，建議采用碘量法這種成本較低的檢驗方法作為初篩方式，對于陽性樣品可以直接拒收，對于未出現(xiàn)陽性反應(yīng)的樣品也應(yīng)送有資質(zhì)的相關(guān)食品檢驗機構(gòu)進行檢驗，確保乳品質(zhì)量；在相關(guān)食品檢驗機構(gòu)應(yīng)按照《乳與乳制品中舒巴坦敏感β-內(nèi)酰胺酶類藥物檢測方法—杯碟法》進行檢驗，且應(yīng)做好方法確認(rèn)，在實驗中可根據(jù)實驗室情況進行優(yōu)化，以保證實驗的準(zhǔn)確性，如有應(yīng)急檢驗可采用杯碟法和快速檢測法一同開展檢驗，快速檢測法獲得初步結(jié)論，杯碟法進行驗證；在大型乳品企業(yè)可采用快速檢測條，在保證檢驗靈敏度的同時，盡可能縮短檢驗時間，保證生鮮乳盡快的投入乳品生產(chǎn)，使人們能享受到更新鮮、更安全的乳品。