分子印跡固相萃取-高效液相色譜法檢測雞肉中的四環(huán)素類抗生素殘留

梁金玲，黃玉霞，何金興

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌產(chǎn)生的含多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的一類抗生素，常見的有四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素和金霉素等[1]。四環(huán)素類抗生素不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和支原體有抑制作用，甚至對衣原體和立克次氏體的活性也有影響[2]，且價格低廉，廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖領(lǐng)域。為了預(yù)防動物疾病、促進(jìn)生長和繁殖，這類抗生素經(jīng)常被濫用，導(dǎo)致其在動物體內(nèi)大量殘留，經(jīng)人食用后具有損害牙齒、骨骼、消化道和肝腎，甚至嚴(yán)重危及人體生命安全的潛在風(fēng)險[3～6]。美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定肌肉中四環(huán)素殘留總量不超過 0.2 mg/kg，牛奶中不超過 0.4 mg/kg[7]。歐盟和我國規(guī)定在動物肌肉組織和奶中的最大殘留量為 100 μg/kg[8,9]。因此，建立方便有效的方法來檢測動物源性食品中的四環(huán)素類抗生素具有重要意義。

目前，四環(huán)素類抗生素檢測方法主要有微生物法[10]，高效液相色譜法[11]，免疫層析法[12]，毛細(xì)管電泳法[13]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14]等。其中，高效液相色譜法是最常用的方法。但由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性，檢測前必須進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理程序。固相萃取技術(shù)因操作簡便、效率高，溶劑用量少等優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)液-液萃取法的缺點，成為目前普遍應(yīng)用的樣品前處理方法。由于食品基質(zhì)的干擾，如何獲得高選擇性的固相萃取材料是目前限制固相萃取樣品前處理技術(shù)的關(guān)鍵。分子印跡技術(shù)是以抗原抗體原理為依托，制備對目標(biāo)分子具有高選擇性聚合物的方法，是目前研究的熱點之一。

本文以鹽酸四環(huán)素為模板，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈作為引發(fā)劑，合成了針對四環(huán)素類抗生素的分子印跡聚合物，并以此材料作為固相吸附材料，建立固相萃取技術(shù)對雞肉樣品中的四環(huán)素類抗生素進(jìn)行提取、富集、凈化，并與高效液相色譜聯(lián)用檢測雞肉樣品中四環(huán)素類抗生素殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AT高效液相色譜儀-SPD檢測器，日本Shimadzu公司；固相萃取儀，Supelco USA；TU1901雙光束紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司。

鹽酸四環(huán)素（TC）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、磺胺氯噠唑（SCP），Sigma公司；鹽酸土霉素（OTC），Solarbio公司；鹽酸強(qiáng)力霉素（DC），上海源葉生物科技有限公司；甲基丙烯酸（MAA），偶氮二異丁腈(AIBN)，分析純，天津市科密歐化學(xué)化學(xué)試劑有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，分析純，上海阿拉??；甲醇、乙腈，色譜純，上海麥克林生化科技有限公司；冰醋酸，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；一水合檸檬酸、無水磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水，MAA和EGDMA在使用前需要減壓蒸餾純化，AIBN需用95%乙醇重結(jié)晶后使用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：準(zhǔn)確稱取TC、OTC、DC標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用甲醇定容至100 mL，配置成100 mg/L的混合溶液。其他標(biāo)準(zhǔn)溶液均由此稀釋而來。

0.1 mol/L的檸檬酸溶液的配置：稱取21.01 g檸檬酸，用水定容至1000 mL。

0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液的配置：稱取71.63 g磷酸氫二鈉，用水定容至1000 mL。

MclIvaine緩沖溶液的配制：將1000 mL 0.1 mol/L的檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液混合，用1 mol/L的鹽酸或NaOH調(diào)PH至4.0±0.05。

0.1 mol/L的Na2EDTA-MclIvaine緩沖溶液的配制：稱取 60.50 g乙二胺四乙酸二鈉放入 1625 mL MclIvaine緩沖溶液中，使其溶解，搖勻。

實驗所用的雞肉取自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil ASB-C18(4.6 mm×250 mm)；檢測器：二極管陣列檢測器；柱溫：30 ℃進(jìn)樣量：20 μL；流速：1 mL/min；檢測波長：357 nm；流動相：A（甲醇∶乙腈=3∶7）∶B（0.01 mol/L 檸檬酸水溶液）=27∶73。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取濃度為10 mg/L的四環(huán)素類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以甲醇為溶劑，逐級稀釋為1.0 mg/L、0.8 mg/L、0.5 mg/L、0.2 mg/L、0.1 mg/L。以濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 分子印跡聚合物的制備

取119 mg TC、175 μL MAA、3 mL乙腈、2 mL甲醇置于50 mL圓底燒瓶中，振蕩30 min；向圓底燒瓶中加入760 μL EGDMA，振蕩15 min；再加入50 mg AIBN，振蕩5 min；60 ℃水浴聚合48 h。反應(yīng)完成后將聚合物材料研磨至粉末狀，利用甲醇乙酸混合溶液（9∶1，V/V）洗脫至無 TC 檢出。用去離子水反復(fù)沖洗2～3次，60 ℃烘干至恒重，待用。非印跡材料除了不加模板分子外，其他的步驟相同。

1.2.4 材料吸附性能表征

1.2.4.1 吸附動力學(xué)實驗

準(zhǔn)確稱取25.0 mg分子印跡聚合物材料，加入5 mL 30 mg/L的 TC-甲醇溶液，分別在室溫下振蕩 5 min、10 min、20 min、30 min、60 min 后，5000 r/min離心15 min。在波長357 nm條件下，采用紫外-可見分光光度計測定上清液中TC的吸光度。按照公式（1）計算聚合物對TC的吸附量。

式中，C0和Ct分別代表吸附前和吸附后 TC的濃度（mg/L），V表示加入TC的體積（mL），m為聚合物質(zhì)量（mg）。

1.2.4.2 平衡結(jié)合實驗

為了考察所制備的分子印跡聚合物對TC的結(jié)合能力，準(zhǔn)確稱取25.0 mg印跡材料和非印跡材料，分別加入5 mL不同濃度的TC-甲醇溶液（20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、70 mg/L、100 mg/L）振蕩30 min，5000 r/min離心15 min。在357 nm的波長下，采用紫外-可見分光光度計測定上清液中TC的吸光度，按照公式（1）計算聚合物對TC的吸附量。

1.2.4.3 選擇性結(jié)合實驗

為了考察聚合物對3種四環(huán)素類抗生素的特異性吸附，選擇與四環(huán)素類抗生素結(jié)構(gòu)類似的SMZ、SCP作為競爭物。準(zhǔn)確稱取25.0 mg印跡材料和非印跡材料于50 mL容量瓶中，各加入5 mL 10 mg/L的TC、OTC、DC、SMZ、SCP的混合甲醇溶液，振蕩30 min，5000 r/min離心15 min。通過HPLC檢測上清液中各分析物濃度，四環(huán)素類抗生素的測定波長為357 nm，磺胺類藥物為270 nm。通過比較吸附前后上清液與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，計算每種物質(zhì)的吸附量、分配系數(shù)（Kd）、選擇性系數(shù)（K）和相對選擇性系數(shù)（K’）。計算公式如下：

1.2.5 樣品處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g雞肉樣品置于50 mL離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L的Na2EDTA-MclIvaine緩沖溶液，渦旋混合1 min，冰水浴超聲提取10 min，3000 r/min離心5 min；重復(fù)提取兩次，合并上清液，過0.45 μm濾膜，待凈化。

準(zhǔn)確稱取0.25 g聚合物材料，填充于5 mL的空的聚丙烯固相萃取柱中的底端篩板上，頂端用聚丙烯篩板壓實。填充完畢后，用5 mL的甲醇和5 mL水預(yù)處理，保持柱體濕潤；取待凈化的樣品，以1 mL/min的速度過固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用 5 mL水和5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去全部流出液；用10 mL甲醇和乙酸混合溶液（9∶1，V/V）洗脫，收集洗脫液；將洗脫液在N2下吹干，用1 mL甲醇復(fù)溶，過0.45 μm濾膜，待測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)處理及作圖采用Origin 8.6軟件和Excel 2016。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

圖1 四環(huán)素紫外吸收曲線Fig.1 The UV absorption curve of TC

取 TC標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用紫外-可見分光光度計在400～190 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果如圖1所示。由圖可知。TC在270 nm處和357 nm處吸收峰較大，但在270 nm處干擾物較多，因此選擇357 nm作為TC的最佳檢測波長。

2.2 流動相的選擇

圖2 1 mg/L的TC-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖Fig.2 The HPLC chromatogram of 1 mg/L TC-Methanol solution

四環(huán)素類抗生素具有酸堿兩性，但在弱酸環(huán)境中比較穩(wěn)定，過酸或堿性均易失效，因此選用的流動相應(yīng)為弱酸性。參考文獻(xiàn)[15,16]的方法，選擇 0.01 mol/L的檸檬酸作為水相，甲醇和乙腈混合溶液作為有機(jī)相，并對甲醇與乙腈的比例，水相與有機(jī)相的比例進(jìn)行了優(yōu)化。實驗結(jié)果表明，當(dāng)甲醇∶乙腈=3∶7，有機(jī)相∶水相=27∶73時，3種四環(huán)素類抗生素能夠完全分離，且所用時間最短。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示。

2.3 分子印跡聚合物吸附性能表征

2.3.1 吸附動力學(xué)實驗

圖3 30 mg/L TC-甲醇溶液在25 mg分子印跡材料上的吸附動力學(xué)Fig.3 The adsorption kinetics of 30 mg/L TC-methanol solution on 25 mg molecularly imprinted materials

為了評價制備的聚合物的傳質(zhì)速度，測定了不同時間下（5～60 min），25.0 mg聚合物對30 mg/L的TC-甲醇溶液的吸附量（圖3）。由圖3可知，吸附5 min后，吸附容量達(dá)到最大吸附容量的83.0%，30 min基本達(dá)到吸附平衡，說明合成的材料具有較快的傳質(zhì)速度。如果四環(huán)素的濃度更低，達(dá)到吸附平衡的時間會更短。

2.3.2 平衡結(jié)合實驗

為了評價合成的聚合物對模板分子TC的結(jié)合能力，在室溫下測定印跡聚合物和非印跡聚合物對20～100 mg/L的TC吸附量的變化趨勢，以TC濃度為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)，繪制TC吸附等溫線（圖4）。由圖4可知，隨著四環(huán)素溶液濃度的增加，印跡聚合物和非印跡聚合物對TC的吸附量均有不同程度的增加。但印跡聚合物的吸附量要明顯高于非印跡，當(dāng)TC的初始濃度為100 mg/L時，印跡聚合物和非印跡聚合物對 TC的吸附量分別為 2.30 mg/g和 1.13 mg/g，印跡聚合物對四環(huán)素的吸附量大約是非印跡聚合物吸附量的2.04倍，說明相較于非印跡聚合物，印跡聚合物對模板分子的吸附性較好。

2.3.3 選擇性吸附

為了評價印跡聚合物對四環(huán)素類抗生素的選擇性，分別選擇印跡材料與非印跡材料對三種四環(huán)素類抗生素、SMZ、SCP進(jìn)行競爭吸附，結(jié)果見表1。由表1可知，印跡材料對四環(huán)素類抗生素的吸附量要大于非印跡材料對四環(huán)素類抗生素的吸附容量，且印跡材料對四環(huán)素類抗生素的吸附量大于對SMZ、SCP的吸附量，印跡材料的Kd大于非印跡材料的Kd，印跡材料對四環(huán)素類抗生素的K小于SMZ、SCP，SMZ、SCP的K’均大于1，說明印跡材料對3種四環(huán)素類抗生素具有較強(qiáng)的選擇識別性。其原因主要是在聚合過程中，TC與MAA的鍵合，使配體進(jìn)行有序的排列，從而形成了一定的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。洗脫除去模板后，形成了特定的空穴，該空穴使得聚合材料具有一定的特異性。而非印跡聚合物中沒有特定的空穴，只是依靠化學(xué)性或物理性吸附，所以具有較低的選擇性。

表1 印跡材料與非印跡材料對四環(huán)素類抗生素、SMZ、SCP的競爭吸附結(jié)果Table 1 Competing adsorption results of tetracyclines, SMZ and DMP between imprinted and non-imprinted materials

2.4 分析方法特征量

2.4.1 線性關(guān)系和方法檢出限

將四環(huán)素類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1～1.0 mg/L）在選定的色譜條件下進(jìn)行測定，線性方程見表 2。在相同條件下，重復(fù)進(jìn)樣 5次，驗證方法的精密度（RSD）。根據(jù)S/N=3計算方法的檢出限。結(jié)果見表2。由表2可知，在0.1～1.0 mg/L范圍內(nèi)，3種四環(huán)素類抗生素的線性關(guān)系良好（R2＞0.99），方法對OTC、TC、DC 3種四環(huán)素類抗生素的最低檢出限分別為 0.12 μg/L、0.13 μg/L、0.14 μg/L，RSD 分別為 1.27%、1.31%、1.94%。

表2 方法的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及精密度Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient, LOD and RSD of SPE-HPLC

表3 雞肉樣品的加標(biāo)回收率Table 3 The recoveries of spiked chicken sample

2.4.2 方法的加標(biāo)回收率

圖5 空白樣品（a）、加標(biāo)樣品（50 μg/kg）（b）的色譜圖Fig.5 Chromatograms of blank samples(a), spiked samples(b)

為了評價所建立方法的準(zhǔn)確性和適用性，選用當(dāng)?shù)爻械碾u肉樣品，測定樣品中3種分析物的殘留情況。經(jīng)測定，確定雞肉樣品中未檢出目標(biāo)分析物。為了進(jìn)一步證明所建方法的準(zhǔn)確性，對樣品進(jìn)行添加回收實驗，添加樣品后 3種分析物的最終濃度為 50 μg/kg，100 μg/kg 和200 μg/kg。對樣品進(jìn)行提取后，固相萃取富集凈化，收集洗脫液，吹干后用1 mL甲醇復(fù)溶，過0.45 μm濾膜，待液相檢測。每個濃度平行測定3次，計算平均加標(biāo)回收率及RSD，見表3。實際樣品的色譜圖見圖5。由表可知，雞肉中的3種四環(huán)素類抗生素的加標(biāo)回收率為 80.94%～94.95%，RSD為1.04%～3.63%，可以滿足雞肉中痕量四環(huán)素類抗生素的痕量檢測要求。由圖5可知，樣品色譜圖中的雜峰較少，說明該樣品前處理方法可以有效的去除食品基質(zhì)的干擾。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，本方法合成的分子印跡聚合物對3種四環(huán)素類抗生素（四環(huán)素、土霉素、強(qiáng)力霉素）具有較強(qiáng)的吸附性和特異識別性，并用該聚合物材料作為固相萃取柱填料，制備固相萃取柱，建立了固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)同時檢測雞肉中3種四環(huán)素類抗生素殘留的方法。該法將富集、凈化和檢測為一體，簡單、快速且靈敏度高，可以用于實際樣品中四環(huán)素類抗生素的檢測。