不同乳酸菌在冬瓜汁中的發(fā)酵特性研究

陳曉維，余元善，吳繼軍，徐玉娟，鄒波

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510631）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

冬瓜（學(xué)名：Benincasa hispida(Thunb.) Cogn.），屬葫蘆科，一年生草本植物，為夏秋季節(jié)主要蔬菜之一[1]。冬瓜含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素以及礦質(zhì)元素等營養(yǎng)成分，還有一定的藥用功效。據(jù)《本草綱目》記載：冬瓜，味甘、微寒、無毒、主治小腹水脹，利小便，止渴。搗汁吸，止消渴煩悶，解毒。益氣耐老，除心滿，去頭面熱，消熱毒痛腫，利大小腸。久服，輕身耐老，補(bǔ)肝明目，悅澤面容。此外，冬瓜中還含有大量的丙醇二酸，能有效地抑制糖類轉(zhuǎn)化為脂肪，對(duì)于防止人體發(fā)胖具有重要意義[2]。冬瓜耐貯藏運(yùn)輸、耐熱性強(qiáng)、肉質(zhì)潔白、脆爽多汁，是適于現(xiàn)代化農(nóng)產(chǎn)品加工的良好原料[3]。目前市場上關(guān)于冬瓜的產(chǎn)品比較單一，主要有冬瓜糖、冬瓜飲料等。但隨著經(jīng)濟(jì)增長和人們生活水平的日益提高，消費(fèi)者的營養(yǎng)與保健意識(shí)日益增強(qiáng)，冬瓜產(chǎn)品已漸漸不能滿足人們的需求，低熱量、低脂肪的蔬菜汁飲料越來越受到人們的青睞，因此天然保健飲料具有廣闊的發(fā)展前景。

乳酸菌是一類以糖為原料發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，活菌體及其代謝產(chǎn)物對(duì)人體具有延緩衰老、調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇、提高免疫力和抑制腫瘤等多方面的保健作用[4]。目前，關(guān)于冬瓜乳酸菌發(fā)酵飲料的報(bào)道還較少，如果將冬瓜汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵，由普通的冬瓜汁飲料發(fā)展成為具有特殊療效作用的功能性冬瓜汁飲料產(chǎn)品，對(duì)于提高人民健康水平、拓展冬瓜加工途徑、增加飲料品種有著重要的意義。

本研究采用經(jīng)鮮榨后再經(jīng)巴氏滅菌的冬瓜汁為原料，加入七種不同乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，比較發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)、pH值、可滴定酸、總糖、還原糖、總多酚、色澤等變化和發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和相對(duì)含量，以期為研發(fā)出一種新型的功能性冬瓜汁乳酸菌發(fā)酵飲料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬瓜，購買于廣東廣州；干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌購自上海潤盈生物工程有限公司；MRS培養(yǎng)基和肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；焦性沒食子酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UHT滅菌裝置，上海雅程有限公司；榨汁機(jī)，美的集團(tuán)公司；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；無菌操作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安康空氣技術(shù)有限公司；UV1800型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；PB-10型pH計(jì)，Sartorius公司；UltraScan VIS型全自動(dòng)色差儀，美國HunterLab公司；Agilent 1200 series型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Agilent 6890N/5975B型氣相色譜-質(zhì)譜連用儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 冬瓜汁制備

將冬瓜去皮去瓤后切成小塊，用榨汁機(jī)榨汁，過兩層紗布，獲得的冬瓜汁用沸水浴煮沸 5 min，罐裝入無菌的玻璃瓶中，貯藏于-20 ℃冷庫中備用。

1.3.2 乳酸菌培養(yǎng)物制備

把7種乳酸菌的保藏培養(yǎng)物分別置于MRS肉湯中進(jìn)行活化復(fù)壯，活化復(fù)壯后再在MRS肉湯（30 ℃，靜止發(fā)酵）中培養(yǎng)18 h。

1.3.3 冬瓜汁的乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)

冬瓜汁解凍后，置于無菌操作臺(tái)上，分別在已滅菌的500 mL三角瓶中加入400 mL冬瓜汁，每瓶分別接入各種乳酸菌培養(yǎng)物（接種量 6.0 Lg CFU/mL左右），置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔8 h取樣1次，并測定相應(yīng)的理化和微生物指標(biāo)。

1.3.4 乳酸菌活菌數(shù)的測定

采用稀釋倒平板法，具體原理和步驟參考 GB 4789.35-2010中乳酸菌菌落總數(shù)的測定方法[6]。

1.3.5 pH和可滴定酸的測定

pH值用pH計(jì)直接測定?？傻味ㄋ岬臏y定：按照GB/T 12293-90《水果、蔬菜制品可滴定酸度的測定》，采用滴定法測定，總酸度以檸檬酸計(jì)[7]。

1.3.6 糖組分的測定

總糖采用苯酚硫酸法測定，結(jié)果以葡萄糖含量計(jì)算[8]。還原糖（蔗糖、果糖和葡萄糖的總含量）的測定采用HPLC法測定[9]。色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm×250 mm）色譜柱；柱溫：30 ℃；檢測器：蒸發(fā)光（ELSD）檢測器；流動(dòng)相：乙腈∶H2O（V/V）=3∶1；流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣量為 10 μL，并采用外標(biāo)（葡萄糖、果糖和蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)品）法定量。

1.3.7 總酚含量的測定

采用福林酚法測定[10]，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示。

1.3.8 冬瓜汁色差的測定

采用色差儀（透視模式）測定發(fā)酵冬瓜汁樣品的色澤（Hunter L、a和b值表示），結(jié)果以總色差值ΔE計(jì)[11]，計(jì)算公式為：ΔE=[(L-L0)^2+(a-a0)^2+(b-b0)^2]1/2式中，L0、a0、b0表示未發(fā)酵冬瓜汁的Hunter參數(shù)；L、a、b表示發(fā)酵冬瓜汁的Hunter參數(shù)。

1.3.9 發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

準(zhǔn)確稱取4 g冬瓜汁樣品，加入1.5 g無水氯化鈉，置于15 mL樣品瓶中，在電熱恒溫加熱攪拌器中50 ℃水浴平衡30 min，再插入老化好的SPME針頭萃取40 min，最后將吸附好分析組分的萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣器中解吸5 min。

GC-MS的色譜條件為采用DB-5MS彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），氦氣為載氣，其流速為20 mL/min；進(jìn)樣口溫度為270 ℃；程序升溫方式為初始溫度35 ℃，以4 ℃/min的速率升至250 ℃，繼續(xù)升至280 ℃并保持10 min。GC-MS的質(zhì)譜條件為EI離子源（70 eV），離子源溫度230 ℃，接口溫度為280 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z10～450。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有的不同處理均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行方差分析（Duncan’s multiple range tests），數(shù)值以平均值±SD表示，并用Origin 8.5.1軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中乳酸菌數(shù)量的變化

圖1 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中乳酸菌數(shù)量的變化Fig.1 Changes of lactic acid bacteria in wax gourd juice during fermentation of different lactic acid bacteria

從圖1可以看出，菌種經(jīng)過了前期的活化和復(fù)壯，在接種到冬瓜汁中后，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，發(fā)酵的前24 h，冬瓜汁中的營養(yǎng)物質(zhì)充足，乳酸菌數(shù)呈指數(shù)增長。其中，干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和雙歧桿菌在開始發(fā)酵8 h時(shí)生長緩慢，其他4種乳酸菌的生長速率接近。發(fā)酵24 h后，荔枝汁中各種乳酸菌總數(shù)均達(dá)到8.5 Lg CFU/mL以上，它們的生長進(jìn)入穩(wěn)定期，在32 h后開始下降，只有干酪乳桿菌還處于穩(wěn)定期。這表明冬瓜汁營養(yǎng)豐富，非常適合乳酸菌生長。

2.2 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中pH值和可滴定酸的變化

由圖2可知，冬瓜汁的最初pH值約為5.25。在40 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，7種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁的pH值均呈下降趨勢；其中，干酪乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁的pH值在發(fā)酵8 h后變化不大，在發(fā)酵前16 h pH值比其他6種菌高；而保加利亞乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁在發(fā)酵前8 h其pH值在干酪乳桿菌和其他5種乳酸菌之間。在發(fā)酵24 h后，七種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁pH值下降趨勢接近，在發(fā)酵40 h后，冬瓜汁的pH值約為3.15。

圖2 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中pH值的變化Fig.2 Changes of pH value in wax gourd juice during fermentation of different lactic acid bacteria

從圖3可看出，冬瓜汁的初始可滴定酸含量約為0.4 g/L。在發(fā)酵40 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，7種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁所產(chǎn)生的可滴定酸呈上升趨勢。

其中，干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌在發(fā)酵40 h內(nèi)的冬瓜汁所產(chǎn)生的可滴定酸呈一直上升趨勢且上升趨勢接近；鼠李糖乳桿菌和保加利亞乳桿菌在發(fā)酵32 h后的冬瓜汁所產(chǎn)生的可滴定酸趨于穩(wěn)定；而雙歧桿菌發(fā)酵的冬瓜汁在發(fā)酵前32 h所產(chǎn)生的可滴定酸都比其他6種乳酸菌所產(chǎn)生的可滴定酸含量高，在24 h時(shí)可滴定酸含量達(dá)到最高值，有4.26 g/L，而在發(fā)酵32 h后其可滴定酸的含量趨于平穩(wěn)。

圖3 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中可滴定酸含量的變化Fig.3 Changes of titratable acid in wax gourd juice during fermentation of different lactic acid bacteria

2.3 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中總糖和還原糖含量的變化

圖4 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中總糖含量的變化Fig.4 Changes of total sugar content in wax gourd juice during fermentation of different lactic acid bacteria

從圖4可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，七種乳酸菌發(fā)酵期間的冬瓜汁中總糖的含量均呈下降的趨勢，在發(fā)酵40 h后，七種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁殘留的總糖含量約為10.83 g/L。其中，鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌的下降趨勢接近，在發(fā)酵32 h時(shí)總糖含量比其他四種乳酸菌高；而干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵期間冬瓜汁總糖含量下降的趨勢相似。在發(fā)酵前32 h，七種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁中總糖含量處于緩慢下降的趨勢，在發(fā)酵32 h后，總糖含量下降速率加快，這可能是在酵32 h前乳酸菌處于對(duì)數(shù)增長期，需消耗的糖較多。

圖5 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar content in wax gourd juice during fermentation of different lactic acid bacteria

圖5提供了冬瓜汁經(jīng)七種不同乳酸菌發(fā)酵期間其還原糖（蔗糖、果糖和葡萄糖的總含量）消耗量的動(dòng)態(tài)變化情況。從圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，七種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁中還原糖含量呈下降趨勢。在發(fā)酵的過程中，嗜酸乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中還原糖的減少速率略快于其他乳酸菌，而植物乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中還原糖的減少速率略低于其他乳酸菌，其他乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁中還原糖的下降趨勢相似。

2.4 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中總酚含量的變化

圖6 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中總酚含量的變化Fig.6 Changes of total phenolic content in wax gourd juice during fermentation of different lactic acid bacteria

由圖 6可知，冬瓜汁中總酚含量不高，約為 35 mg/L。在發(fā)酵前16 h，七種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁中總酚含量均呈下降趨勢，而嗜酸乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中總酚含量下降速率最快，其次是鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌，兩者下降趨勢相似；其他四種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁中總酚含量下降較為緩慢。在發(fā)酵期間，七種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁中總酚含量都呈先下降后上升的趨勢，其中除嗜酸乳桿菌之外的6種乳酸菌均在發(fā)酵32 h后總酚含量上升，雙歧桿菌上升速率最快，其次分別為植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、保加利亞乳桿菌，而嗜酸乳桿菌在發(fā)酵16 h后總酚含量開始上升，但上升的趨勢較為緩慢。在發(fā)酵40 h后，雙歧桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中總酚含量最高，約為80.74 mg/L；而嗜酸乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中總酚含量最低，約為23.47 mg/L。

2.5 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中色差的變化

圖7 不同乳酸菌種發(fā)酵期間冬瓜汁中色差的變化Fig.7 Changes of chromatic aberration in wax gourd juice during fermentation of different lactic acid bacteria

由圖7可以看出，與原汁相比，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，7種不同乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁的色差值均呈增大趨勢。其中，發(fā)酵16 h時(shí)，嗜熱鏈球菌發(fā)酵的冬瓜汁的色差值最大，為4.67，發(fā)酵16 h后呈下降的趨勢；雙歧桿菌發(fā)酵的冬瓜汁在發(fā)酵期間色差值呈一直增加的趨勢，在發(fā)酵40 h后，色差值為4.54；鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁的色差值在發(fā)酵24 h時(shí)達(dá)到最大值，發(fā)酵24 h后呈下降的趨勢；其他4種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁的色差值均在發(fā)酵32 h時(shí)色差值最大，發(fā)酵32 h后呈下降的趨勢。

2.6 不同乳酸菌種發(fā)酵冬瓜汁后揮發(fā)性成分種類和相對(duì)含量

表1是不同乳酸菌種發(fā)酵冬瓜汁后其主要香氣成分種類和相對(duì)含量。從表1可知，乳酸菌發(fā)酵后冬瓜汁中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要有酸類、醇類、酯類、醛類和酮類五類。干酪乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中共檢出114種揮發(fā)性物質(zhì)，嗜熱鏈球菌發(fā)酵的冬瓜汁中共檢出116種，植物乳桿菌共檢出109種，嗜酸乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中共檢出107種，鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中都共檢出108種，保加利亞乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的揮發(fā)性物質(zhì)最多，有122種。其中，干酪乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的酸類物質(zhì)和醇類的相對(duì)含量較高，明顯多于其他類物質(zhì)；嗜熱鏈球菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的酸類和醇類含量較高，明顯高于其他類物質(zhì)；植物乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的酸類和醛類含量較高；而嗜酸乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的酸類物質(zhì)的相對(duì)含量最低，只有11.62%；鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的酸類含量明顯高于其他類物質(zhì)；雙歧桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的酸類物質(zhì)含量最高，占59.42%；保加利亞乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的酸類和醛類物質(zhì)含量相對(duì)較大，明顯多于其他類物質(zhì)。

表1 不同乳酸菌種發(fā)酵冬瓜汁后揮發(fā)性成分種類和相對(duì)含量Table 1 Different lactobacillus fermented wax gourd melon juice species and the relative content of volatile components

3 結(jié)論

3.1 冬瓜汁營養(yǎng)豐富，上述各種乳酸菌均能在冬瓜汁中較好生長而產(chǎn)生菌體。在發(fā)酵過程中，七種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁均產(chǎn)酸，其可滴定酸均呈上升的趨勢，雙歧桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中可滴定酸含量高于其他六種乳酸菌。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，七種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁中總糖和還原糖含量均呈下降趨勢，在發(fā)酵32 h后，總糖和還原糖含量下降速率加快，這可能是由于在發(fā)酵32 h前乳酸菌處于對(duì)數(shù)增長期，需消耗的糖較

多。本研究中，乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁中總多酚含量在發(fā)酵的前32 h均呈下降趨勢，在發(fā)酵32 h后增加，這可能是冬瓜汁中一些結(jié)合態(tài)的多酚被乳酸菌產(chǎn)生的一些糖苷酶或酯酶水解釋放所致[12]。

3.2 與原汁相比，在乳酸菌的發(fā)酵期間，冬瓜汁的總色差值也呈增加趨勢。在冬瓜汁乳酸菌發(fā)酵和貯藏期間，多酚的氧化和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物都能導(dǎo)致冬瓜汁顏色發(fā)生變化[13]。其中雙歧桿菌發(fā)酵的冬瓜汁的總色差值一直處于增加的趨勢，說明雙歧桿菌不適合用于發(fā)酵冬瓜汁。七種乳酸菌發(fā)酵后冬瓜汁中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要有酸類、醇類、酯類、醛類、酮類、硅氧烷類六類，保加利亞乳桿菌發(fā)酵的冬瓜汁中檢出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最多。除雙歧桿菌之外其他六種乳酸菌發(fā)酵的冬瓜汁理化性質(zhì)差別不大，雙歧桿菌發(fā)酵的冬瓜汁在總色差上明顯高于其他乳酸菌。