FAS2基因過表達(dá)對釀酒酵母風(fēng)味酯生成能力的影響

杜永靜，陳葉福，李潔，何亞輝，龔瑞，郭學(xué)武，肖冬光

（天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

白酒是我國特有的蒸餾酒，在人們的日常生活中占有重要地位，酯類作為白酒中含量最多的香味成分之一，種類較多，是白酒香氣的物質(zhì)基礎(chǔ)，對白酒的風(fēng)味和香型起著關(guān)鍵性作用。適量的酯可使酒體豐滿，香味協(xié)調(diào)，給飲酒者帶來喜悅感。白酒中酯類主要分為兩大類，乙酸酯類和脂肪酸乙基酯類。乙酸酯類主要包括：乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸異丁酯等，在各種香型白酒中含量均較高，對白酒風(fēng)味貢獻(xiàn)比較大，其中乙酸乙酯是清香型、芝麻香型等多種香型白酒的主體香；乙基酯主要有丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等[1]。我國名優(yōu)白酒中以含乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯四大酯為主，其和占總酯含量的80%以上，含量多少與白酒香型相關(guān)[2]。

以己酸乙酯為主體香成分的濃香型白酒，是我國產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的白酒。己酸乙酯是濃香型白酒的主體香，然而釀酒酵母自身雖然具有極強(qiáng)的酒精發(fā)酵效率，但其產(chǎn)酯能力極低。在酵母發(fā)酵過程中，代謝產(chǎn)物己酸乙酯含量很少，一般在0.5 μg/mL左右。能否讓釀酒酵母大量合成和分泌己酸乙酯，是一個長期困擾我國白酒界的問題[3]。

影響白酒釀造最終產(chǎn)己酸乙酯的因素很多，如酵母菌種，原料、糖化劑及發(fā)酵工藝等[4,5]。白酒中己酸乙酯等中鏈脂肪酸乙基酯主要是在酒精發(fā)酵后期，由大曲和窖泥中酯化能力極強(qiáng)的霉菌（根霉、毛霉和曲霉）在酯化酶的作用下酯化己酸和酵母產(chǎn)生的乙醇合成，但其發(fā)酵周期長，糧耗大[6]。工業(yè)上為了提高白酒的酯含量，通常采用的方法有：添加生香酵母、延長發(fā)酵期和窖藏時間[7]。然而這些方法在提高酯產(chǎn)量的同時，增加了人力和物力的消耗，延長發(fā)酵期還帶來了糠嗅味、澀味、酸味等異味，會降低白酒品質(zhì)[8]。為提高釀酒酵母產(chǎn)己酸乙酯的能力，使得釀酒酵母在主發(fā)酵期，保持其高產(chǎn)乙醇特性的同時高產(chǎn)己酸乙酯，以達(dá)到縮短白酒發(fā)酵周期、減少糧耗的目的，故有必要構(gòu)建高產(chǎn)己酸乙酯的釀酒酵母菌株。因此，研究和構(gòu)建高產(chǎn)己酸乙酯釀酒酵母用于白酒生產(chǎn)，對于改善白酒風(fēng)味和品質(zhì)具有重要意義[9,10]。本研究以實驗室前期構(gòu)建的α5F-FAS1及α5O-FAS1作為出發(fā)菌株[11]，過表達(dá)FAS2基因，從而獲得FAS1，F(xiàn)AS2共同過表達(dá)的菌株α5F-FAS1,2和α5O-FAS1,2，研究共表達(dá)FAS基因?qū)χ墟溨舅嵋阴ギa(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY15的單倍體α5均為天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實驗室保藏。其中質(zhì)粒Yep352-P為本實驗室保存，質(zhì)粒pUC6由德國Hegemann教授惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

YEPD培養(yǎng)基（m/V）：葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨2%。

LB培養(yǎng)基（m/V）：葡萄糖1%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%。

以上兩種培養(yǎng)基，自然pH值，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米糖化醪。

1.1.3 試劑和酶

限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、rTaq聚合酶、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR純化試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；卡納霉素（KanMX）購自Merck公司；酵母基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.4 儀器

PCT-200型PCR基因擴(kuò)增儀，臺式高速離心機(jī)，電熱恒溫水浴鍋電子天平，DYY-4c型電泳儀，Reference-2型移液槍，DL102x型電熱鼓風(fēng)干燥箱，AgilentGC 7890，StepOnePlus?實時熒光定量PCR儀。

1.2 實驗方法

本實驗采用同源重組基因改造的方法，同時結(jié)合質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)將相應(yīng)基因連接到載體Yep352-P上，然后以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Hxt16基因為整合位點(diǎn)，過表達(dá)脂肪酸合成酶亞基FAS2基因，并篩選得到重組菌株。

1.2.1 引物

本實驗所用到的PCR反應(yīng)引物見表1，引物設(shè)計均采用Primer 5.0軟件設(shè)計。具體引物說明如下：根據(jù)NCBI公布的釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的FAS2基因，設(shè)計用于擴(kuò)增 FAS2基因的引物對FAS2-U/FAS2-D。根據(jù)pUC6質(zhì)粒序列設(shè)計用于擴(kuò)增KanMX抗性基因序列的引物KAN-U和KAN-D。根據(jù)NCBI公布S. cerevisiaeS288c的Hxt16基因序列，設(shè)計用于擴(kuò)增 HXT16上游同源臂序列FA的引物對FA-U(Hxt16)/FA-D(Hxt16)，及 HXT16下游同源臂序列 FB的引物對 FB-U(Hxt16)/FB-D(Hxt16)。根據(jù)Yep352-P質(zhì)粒序列設(shè)計用于擴(kuò)增過表達(dá)片段的引物對PGK1P-U/PGK1T-D。

1.2.2 重組質(zhì)粒Yep-PF2質(zhì)粒構(gòu)建

將純化過的 FAS2片段用 Xho1酶切連入Yep352-P，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒Yep-PF2。構(gòu)建過程詳見圖1。

圖1 質(zhì)粒Yep-PF2的構(gòu)建Fig.1 Flow chart of recombinant plasmid Yep-PF2 construction

表1 PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化

從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）α5的基因組上擴(kuò)增得到上下同源臂FA和FB，從質(zhì)粒Yep-PF2上擴(kuò)增得PGK1p-FAS2-PGK1T片段，從質(zhì)粒pug6上擴(kuò)增得loxp-KANMX-loxp片段，使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[12]轉(zhuǎn)化到釀酒酵母α5中，涂布含 1000 μg/mL G418 YEPD平板，30 ℃，靜置培養(yǎng)48 h，對YEPD平板上生長的單菌落進(jìn)行篩選驗證。

1.2.4 發(fā)酵驗證

從YEPD斜面上挑取1環(huán)菌種接入含5 mL一級種子培養(yǎng)基的試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，進(jìn)入穩(wěn)定期后，按照10%的接種量將其接種到含45 mL二級種子培養(yǎng)基的三角瓶中。

30 ℃靜置培養(yǎng)16～17 h至對數(shù)期的后期，然后按照10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。30 ℃靜置發(fā)酵，每隔12 h稱重1次，發(fā)酵結(jié)束后測定CO2累計失重、發(fā)酵時間、酒精度、發(fā)酵液殘余還原糖及酯的含量，每個樣品做3個平行，取平均值。

1.3 分析方法

1.3.1 CO2失重的測定

在發(fā)酵過程中，按照文獻(xiàn)[13]描述的方法每隔12 h稱重1次。

1.3.2 還原糖的測定?

斐林試劑法[13]。

1.3.3 酒精度的測定

酒精計比重法[13]。

1.3.4 酯測定方法

1.3.4.1 乙酸乙酯測定方法[14]

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，得到含乙酸乙酯的樣品進(jìn)行氣相色譜分析。根據(jù)Agilent GC7890氣相色譜說明書及有關(guān)白酒樣品檢測資料設(shè)定檢測高級醇的最佳條件為：色譜柱：105 m×0.530 mm毛細(xì)管柱；柱溫50 ℃保持8 min，然后以5 ℃/min的速度升溫至150 ℃，再保持15 min；進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測器溫度 200 ℃；載氣流速 20 mL/min；氫氣流速 30 mL/min；空氣流速400 mL/min；尾吹速度25 mL/min；分流比 10∶1；進(jìn)樣量 1 μL。

1.3.4.2 中鏈脂肪酸乙酯測定方法[11,15]

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，得到含中鏈脂肪酸乙酯的樣品進(jìn)行氣相色譜和氣質(zhì)色譜（GC-MS）分析。將酒樣稀釋至12%(V/V)，取8 mL置于20 mL螺口頂空樣品瓶，加3 g氯化鈉，放入磁性轉(zhuǎn)子，用聚四氟乙烯將瓶口緊密封好。樣品在恒溫磁力攪拌器中60 ℃平衡 10 min，將萃取頭插入瓶內(nèi)頂空吸附 40 min。萃取后將萃取頭插入GC-MS系統(tǒng)進(jìn)樣口，250 ℃解吸附5 min。

1.3.4.3 氣相色譜條件

色譜柱為 Agilent CP-Wax（60 m×0.25 mm×0.5 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流；載氣氦氣流速為0.8 mL/min；升溫程序為起始40 ℃維持2 min，按照2 ℃/min的速度升到100 ℃，再按照4 ℃/min的速度升到230 ℃，維持3 min。質(zhì)譜條件：EI；70 eV；掃描范圍30～500 u；離子源溫度230 ℃。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

每組實驗做三個平行，并使用 SPSS 11.0和EXCEL 2013軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變株的構(gòu)建與驗證

2.1.1 重組質(zhì)粒Yep-PF2構(gòu)建與驗證

圖2 重組質(zhì)粒Yep-PF2的驗證Fig.2 The verification of recombinant plasmid of Yep-PF2

使用1.2的方法，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒Yep-PF2。對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果如圖 2所示。其中 1道為Yep-PF2用XhoI酶切后的線性化片段，分別存在大小為6958 bp和5664 bp的條帶；2道為以a5基因組為模板擴(kuò)增得到的FAS2基因片段，大小為5664 bp；3道為Yep-P用XhoI酶切后的線性化質(zhì)粒，大小為6958 bp。酶切結(jié)果與理論預(yù)期相符，說明FAS2基因片段成功插入到Y(jié)ep-P上的PGK1啟動子和終止子中間的多克隆位點(diǎn)處，Yep-PF2質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.2 過表達(dá)FAS2基因突變株的構(gòu)建與驗證

圖3 重組片段的同源重組示意圖Fig.3 The process of homologous recombination

用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將四個片段：上同源臂FA、下同源臂 FB、PGK1p+FAS2+PGK1T片段、loxP-KanMX-loxP基因片段導(dǎo)入釀酒酵母α5F-FAS1及α5O-FAS1。通過FA和FB片段與酵母基因組上HXT16基因兩側(cè)的同源序列發(fā)生同源重組，從而實現(xiàn)了FAS2基因的過表達(dá)盒整合到釀酒酵母染色體上。同源重組過程如圖3。將導(dǎo)入片段的菌液涂布在含有1000 mg/L G418抗性的YEPD平板上，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗證。分別以長勢較好的轉(zhuǎn)化子基因組為模板，以出發(fā)菌株α5F-FAS1及α5O-FAS1的基因組為陰性對照，分別用三對引物進(jìn)行驗證，驗證過程如圖4。

圖4 突變株的驗證過程Fig.4 The verification of transformants

引物對Ⅰ：Hxt16驗-U/KAN-D進(jìn)行上游定點(diǎn)PCR驗證，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條大小約2655 bp左右的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)，而出發(fā)菌株無法擴(kuò)增出條帶。

引物對Ⅱ：KAN-U/PGK1P-D進(jìn)行中游定點(diǎn)PCR驗證，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條大小約3092 bp左右的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)，而出發(fā)菌株無法擴(kuò)增出條帶。

引物對Ⅲ：PGK1T-U/Hxt16驗-D進(jìn)行下游定點(diǎn)PCR驗證，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條大小約3553 bp左右的特異性條帶，其大小與預(yù)期相當(dāng)，而出發(fā)菌株無法擴(kuò)增出條帶。說明片段已經(jīng)成功連接并整合到釀酒酵母單倍體基因組中的HXT16位點(diǎn)，得到FF1F2和OF1F2突變株。結(jié)果如圖5所示。

圖5 突變株α5F-FAS1,2的驗證Fig.5 The verification of transformants α5F-FAS1,2

2.2 出發(fā)菌株與突變菌株的發(fā)酵性能比較

按照方法 1.2.5以出發(fā)菌株α5為對照菌株與α5F-FAS1、FF1F2、α5O-FAS1、OF1F2同時進(jìn)行玉米原料發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測定各菌株的基本發(fā)酵性能。

由表2可知，與出發(fā)菌株α5相比，敲除FAA1同時過表達(dá)FAS1基因后突變菌和敲除OPI1同時過表達(dá)FAS1基因后突變菌的主要發(fā)酵性能總CO2失重、酒精度和殘?zhí)菦]有明顯的影響。在過表達(dá)FAS1基因的基礎(chǔ)上過表達(dá)FAS2的主要發(fā)酵性能也未受明顯影響。

表2 突變株的發(fā)酵性能比較Table 2 The comparison of the fermentation performance of mutants

2.3 共表達(dá)FAS1，F(xiàn)AS2基因?qū)χ墟溨舅嵋阴ド闪康挠绊?/p>

發(fā)酵結(jié)束后，對發(fā)酵醪進(jìn)行蒸餾，獲得的酒樣經(jīng)過頂空萃取和吸附后，用GC-MS檢測分析酒樣中己酸乙酯等脂肪酸乙酯生成量。

圖6 出發(fā)菌株和突變菌株中鏈脂肪酸乙酯的生成量比較Fig.6 The comparison of medium chain fatty acid ethyl esters production between original strain and recombinant strains

如圖6所示，相比較于α5F-FAS1菌株，在此基礎(chǔ)上共表達(dá)FAS2的菌株的FF1F2的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯分別提升了 154.31%，65.22%和23.53%，但十二酸乙酯、十四酸乙酯基本不變。與此結(jié)果類似：相比較于α5O-FAS1菌株，在此基礎(chǔ)上共表達(dá)FAS2的菌株的OF1F2的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯分別提升了17.34%，30.71%，27.12%和28.13%，但十四酸乙酯基本不變。結(jié)果顯示共表達(dá)FAS1和FAS2基因可以更進(jìn)一步的提升中鏈脂肪酸乙酯的產(chǎn)量，特別是己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的產(chǎn)量，最終的最高產(chǎn)量分別達(dá)到4.049 mg/L，3.89 mg/L，2.34 mg/L。

實驗結(jié)果與 Furukawa等在清酒酵母中過表達(dá)FAS1可以提高己酸乙酯，并且共表達(dá)FAS1和FAS2可以使己酸乙酯的產(chǎn)量達(dá)到最大的結(jié)論一致[16]。由于脂肪酸合成酶是由兩個亞基組成，它們對于脂肪酸合成酶的酶活力都有貢獻(xiàn)，并且編碼β亞基的基因FAS1其主要作用，其可以在RNA水平上調(diào)節(jié)編碼α亞基的基因FAS2的表達(dá)，從而提高脂肪酸合成酶的酶活力。并且同時共表達(dá)FAS1和FAS2使得α亞基和β亞基以等摩爾的形式存在[17]，從而使脂肪酸合成酶達(dá)到最大的酶活力，進(jìn)一步提升了中鏈脂肪酸乙酯的含量。

2.4 共表達(dá)FAS1，F(xiàn)AS2基因?qū)σ宜嵋阴ド闪康挠绊?/p>

本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)FAS1可以提高乙酸乙酯的生成量。突變株的乙酸乙酯及乙酸的生成量結(jié)果如表3。

表3 過表達(dá)FAS1和共表達(dá)FAS1,2的乙酸乙酯和乙酸產(chǎn)量Table 3 The production of Acetate and Ethyl ester between Co-overexpression of FAS1 and FAS2 strains and overexpression of FAS1 strains

從表3可以看出，過表達(dá)FAS1可以提高乙酸乙酯的含量同時降低乙酸的含量。而共表達(dá) FAS1,2會進(jìn)一步提高乙酸乙酯并降低乙酸的含量。并且敲除Opi1過表達(dá)FAS1的菌株α5O-FAS1比敲除FAA1過表達(dá)FAS1的菌株α5F-FAS1產(chǎn)生的乙酸乙酯更高，同樣共表達(dá)FAS1,2的菌株OF1F2比FF1F2產(chǎn)生的乙酸乙酯更高。說明不同整合位點(diǎn)對乙酸乙酯的生成量也有影響。

圖7 釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)acetyl-CoA的代謝途徑Fig.7 The metabolic pathway of acetyl-CoA in cytoplasm in S.cerevisiae

圖7是釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)中乙酰CoA的代謝途徑，由于在細(xì)胞質(zhì)中乙酰 CoA一部分在醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶Atf1p和Atf2p催化下形成乙酸乙酯，另一部分通過脂肪酸合成途徑形成脂肪酸乙酯，因此實際上脂肪酸合成途徑和乙酸乙酯合成途徑存在相互競爭底物乙酰CoA的情況，當(dāng)過表達(dá)FAS基因后，理論上乙酸乙酯的生成量應(yīng)該降低。因此表3的結(jié)果似乎與理論不符。

由于過表達(dá)FAS1導(dǎo)致了乙酸的降低，癌癥細(xì)胞的背景與此現(xiàn)象類似。相比較于正常細(xì)胞，癌細(xì)胞的脂肪酸合成能力變強(qiáng)，同時大部分癌細(xì)胞存在于低氧低營養(yǎng)的惡劣環(huán)境中，許多研究學(xué)者都發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞通過ACSS基因的上調(diào)，從而利用乙酸維持癌細(xì)胞的存活[18,19]。猜測乙酸乙酯升高的第一種原因可能是過表達(dá)脂肪酸合成酶基因使乙酰 CoA的上游途徑基因ACS1或ACS2基因上調(diào)。另一方面由于乙酸乙酯主要是由醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶Atf1p催化，并且ATF1基因會受到氧氣，氮信號，不飽和脂肪酸等的調(diào)控[20,21]。因此猜測乙酸乙酯升高的第二種原因是過表達(dá)脂肪酸合成酶基因可能使乙酸乙酯的調(diào)控基因ATF1上調(diào)。

為了探究本現(xiàn)象，以出發(fā)菌株α5和突變株α5O-FAS1進(jìn)行玉米原料發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)48 h取菌體提RNA進(jìn)行RT-PCR。

圖8 α5和α5O-FAS1中ACS1，ACS2，F(xiàn)AS2，ATF1的基因表達(dá)量Fig.8 Determination of ACS1, ACS2, FAS2, ATF1 gene expression levels in α5 and α5O-FAS1

如圖8，F(xiàn)AS1基因過表達(dá)并未影響ACS1基因的表達(dá)量，但會提高ACS2的和ATF1基因的表達(dá)量，分別提高了4.75倍和2.93倍，同時也使FAS2基因表達(dá)量提高了2.11倍。因此過表達(dá)FAS1導(dǎo)致乙酸乙酯的升高一方面可能是由于ACS2基因的表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致的，另一方面也可能是由于ATF1基因的表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致的。

一方面為了進(jìn)一步確定乙酸乙酯的上升是由于哪一種原因造成的，另一方面為了探索不同整合位點(diǎn)導(dǎo)致乙酸乙酯提升程度不同的原因，本研究以α5，α5F-FAS1，α5O-FAS1為出發(fā)菌株，同時過表達(dá)ATF1基因，得到α5-ATF1，F(xiàn)F1-ATF1，OF1-ATF1三株突變株，進(jìn)行玉米白酒液態(tài)發(fā)酵。氣相測定乙酸乙酯及乙酸產(chǎn)量如表4。同時測定了α5，α5F-FAS1，α5O-FAS1菌株的FAS1和FAS2基因的表達(dá)量。

表4 過表達(dá)ATF1和共表達(dá)FAS1,ATF1的乙酸乙酯和異戊醇產(chǎn)量Table 4 The production of higher alcohols and estersbetween Co-overexpressionof FAS1 and ATF1 strains and overexpressionof ATF1 strains

表 4結(jié)果顯示與α5-ATF1相比，F(xiàn)F1-ATF1和OF1-ATF1的乙酸乙酯產(chǎn)量分別為277.1 mg/L和73.7 mg/L，出現(xiàn)逐漸遞減的現(xiàn)象。假如脂肪酸合成途徑的強(qiáng)化導(dǎo)致乙酸乙酯的升高是ACS2基因的表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致的，那么過表達(dá) ATF1基因后，菌株 FF1-ATF1和OF1-ATF1生成的乙酸乙酯量應(yīng)該比α5-ATF1菌株的高。此結(jié)果可以說明脂肪酸合成途徑的強(qiáng)化導(dǎo)致乙酸乙酯的升高并不是ACS2基因的表達(dá)量導(dǎo)致的，而是由于ATF1基因的表達(dá)量上調(diào)造成的。

圖9 α5，α5F-FAS1和α5O-FAS1中FAS1，F(xiàn)AS2的基因表達(dá)量Fig.9 Determination of FAS1 and FAS2 gene expression levels in α5, α5F-FAS1 and α5O-FAS1

圖9顯示整合Opi1過表達(dá)FAS1的菌株α5O-FAS1比整合FAA1過表達(dá)FAS1的菌株α5F-FAS1的FAS2的基因表達(dá)量更高。該結(jié)論與表3-2所出現(xiàn)的共表達(dá)FAS1和FAS2的菌株比單獨(dú)過表達(dá)FAS1產(chǎn)生更多的乙酸乙酯相符合。結(jié)果說明菌株α5O-FAS1比菌株α5F-FAS1產(chǎn)生的乙酸乙酯更高，是由于Opi1基因是脂肪酸合成途徑的負(fù)調(diào)控基因[22]，其敲除強(qiáng)化了脂肪酸合成途徑導(dǎo)致的。

3 結(jié)論

3.1 本研究以釀酒酵母AY15的單倍體α5基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到編碼α亞基的FAS2基因，經(jīng)醋酸鋰轉(zhuǎn)化和G418抗性篩選鑒定獲得共表達(dá)FAS1和FAS2基因的突變株α5F-FAS1,2和α5O-FAS1,2。經(jīng)玉米原料發(fā)酵后，實驗結(jié)果顯示突變株的生長速度、發(fā)酵速度、酒精度等基本發(fā)酵性能都沒有明顯變化。相比較于單獨(dú)過表達(dá)FAS1基因，共表達(dá)FAS1和FAS2基因可以更進(jìn)一步的提升中鏈脂肪酸乙酯的生成量，最終α5F-FAS1,2的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯分別提升了 154.31%，65.22%和 23.53%，同時α5F-FAS1,2的己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯分別提升了 17.34%，30.71%，27.12%和28.13%。

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)脂肪酸合成酶的編碼基因可以提高乙酸乙酯的生成量。通過RT-PCR測定發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成酶編碼基因的過表達(dá)可以使ACS2和ATF1基因上調(diào)，不影響ACS1基因的表達(dá)。而與單獨(dú)過表達(dá)ATF1基因的菌株相比，共表達(dá)FAS1和ATF1的菌株的乙酸乙酯逐漸降低。因此過表達(dá)FAS1導(dǎo)致的乙酸乙酯生成量上升的現(xiàn)象主要是由于過表達(dá)脂肪酸合成酶編碼基因使得醇?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因ATF1的表達(dá)量上升造成的。但ATF1的表達(dá)量上調(diào)的原因是否是通過某些中間調(diào)節(jié)因子造成尚不清楚，需要在后續(xù)在調(diào)控機(jī)理上進(jìn)行更深入的研究。

3.3 本研究初步探討了脂肪酸合成酶復(fù)合體對釀酒酵母中鏈脂肪酸乙酯生成的影響，為后續(xù)研究中鏈脂肪酸乙酯合成的調(diào)控機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。