豬源金黃色葡萄球菌lsa(E)基因的流行性研究

谷立慧，周文淵，王麗，閆鶴

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）廣泛分布于自然界，也存在于人和動物的體表、鼻腔和消化道等部位，是一類共生的人畜共患條件致病菌，能夠引起人和動物局部化膿性感染、肺炎、心包炎和膿包敗血癥等，是全球公認的醫(yī)院感染病原菌的代表菌株[1,2]。在我國，20～25%的細菌性食物中毒事件是由金黃色葡萄球菌引起的，是僅次于沙門氏菌和副溶血弧菌的第三大致病菌[3,4]。在獸醫(yī)臨床上可廣泛引起疾病，降低動物生產(chǎn)力，危害家畜健康。由于畜牧業(yè)發(fā)展的集約化和規(guī)模化，抗生素在我國養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用，以促進生長、預(yù)防及治療疾病[5]。金葡菌的適應(yīng)性極強，能夠?qū)π峦度胧褂玫目股匮杆佼a(chǎn)生耐藥性[6]，嚴重的耐藥問題為其防控與治療帶來了極大挑戰(zhàn)。自2005年首例豬源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染人的病例在荷蘭報道后[7]，動物源金葡菌開始備受關(guān)注，它不僅影響畜禽動物的安全防治，甚至可能通過環(huán)境-人、食物鏈-人以及人-人等多種方式進行傳播，威脅人類健康。

lsa(E)基因，屬于ABC轉(zhuǎn)運基因，編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白，能同時介導(dǎo)三類不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥（林克胺類、截短側(cè)耳素類和鏈陽菌素A類）[8]，這三類抗菌藥物均為人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上非常重要的抗感染藥物。2013年，多重耐藥基因lsa(E)首次在歐洲人源MRSA和MSSA中被檢出[8]，同年，Li等人在豬源MRSA中檢測到lsa(E)基因，并通過序列分析證實該基因位于多重耐藥基因簇中[9]。隨后，該基因在多種細菌中被發(fā)現(xiàn)，包括：糞腸球菌[10]、屎腸球菌[10]、表皮葡萄球菌[11]、無乳鏈球菌[12]、豬丹毒桿菌[13]等。動物源 lsa(E)基因及其多重耐藥基因簇在不同菌株間進行的水平傳播，甚至在動物、食品和人之間的交互傳播擴散，對獸醫(yī)臨床和人醫(yī)臨床造成嚴重威脅。

目前，國內(nèi)對于 lsa(E)基因及其耐藥基因簇在動物源金黃色葡萄球菌中的流行特點及傳播方式研究少有報道。因此，本研究以廈門三大生豬養(yǎng)殖場中分離的金黃色葡萄球菌為研究對象，檢測 lsa(E)基因及其耐藥基因簇的流行分布情況，分析 lsa(E)基因簇在豬源金葡菌中的傳播方式，調(diào)查 lsa(E)基因陽性金葡菌對臨床抗菌藥物的耐藥性，從而為我國開展動物源金葡菌的風(fēng)險評估以及降低多重耐藥菌隨食品鏈的傳播提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2014年從中國廈門三個大型生豬養(yǎng)殖場共采集樣本168份，其中環(huán)境樣本71份，豬鼻拭子97份，樣品于4 ℃保存，并參照國標GB 4789.10-2016的方法進行金黃色葡萄球菌的分離鑒定。其中22株金葡菌分離自豬鼻拭子，另外7株菌分離自環(huán)境樣本。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GeneAmp PCR system 2700，美國 Applied Biosystems公司；Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)、核酸電泳儀，美國BIO-RAD公司；恒溫培養(yǎng)箱，德國Binder公司。超凈工作臺，美國Baker公司；超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；高壓滅菌鍋、-80 ℃冰箱，日本三洋公司；電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基和主要試劑

腦心浸出液肉湯，購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒，購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；rTaq酶（5 U/μL）、dNTP Mixture、10×PCR Buffer，購自日本 TaKaRa公司；5×Loading Buffer、DL2000 DNA marker、瓊脂糖，購自艾迪生物科技有限公司；引物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 基因檢測

根據(jù)細菌基因組DNA快速提取試劑盒說明書進行DNA的提取。將提取的細菌總DNA作為模板，采用PCR方法檢測lsa(E)基因，以NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的豬源MRSA PV7037(JX560992)的lsa(E)基因環(huán)境序列為參考（圖1）。

設(shè)計引物，對 lsa(E)基因陽性菌株，進行overlapping PCR，基因引物及退火溫度見下表1。據(jù)此檢測多重耐藥基因簇的流行情況。PCR總反應(yīng)體系為 25 μL，擴增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min、退火溫度(表 1)，1 min、72 ℃，2 min，30 個循環(huán)；72 ℃，7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照并分析，將陽性產(chǎn)物送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序，對測序結(jié)果進行 NCBI序列比對分析。

圖1 lsa(E)的基因環(huán)境Fig.1 Genetic environment of the lsa(E) gene

1.5 抗菌藥物敏感試驗

采用CLSI推薦的紙片擴散法（Kirby-Bauer，K-B）進行抗生素藥物敏感性試驗，結(jié)果按照CLSI（2012）標準進行結(jié)果判斷。測試的抗生素有：青霉素、苯唑西林、頭孢西丁、頭孢噻吩、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星、喹奴普汀/達福普汀、利奈唑胺、復(fù)方新諾明、克拉霉素、克林霉素、慶大霉素。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213，由本實驗室保存。

表1 lsa(E)基因和overlapping PCR引物Table 1 The Primers for lsa(E) gene and overlapping PCR

2 結(jié)果與討論

2.1 lsa(E)基因檢測

2013年，Sarah等[8]人首次在人源MRSA和MSSA中發(fā)現(xiàn)并定義lsa(E)基因，同年，Li等人在江蘇及浙江豬場中分離得到的豬源 MRSA中檢測到 lsa(E)基因，檢出率為22.9%(16/70)[9]。2014年Yan等[14]對中國哈爾濱兩個屠宰場的豬源金葡菌進行 lsa(E)基因篩查，檢測率為22.0%(44/200)。

在本研究中，對于廈門豬場分離得到的金葡菌中l(wèi)sa(E)基因的檢出率為 100.0%(29/29)，表明近兩年lsa(E)基因在我國豬源金葡中廣泛傳播，該結(jié)果與李君[15]對上海、寧夏、河南及山東的豬源MRSA的lsa(E)基因的檢出率相同。lsa(E)基因在越來越多細菌中的發(fā)現(xiàn)及檢出率的顯著提高表明可能存在可移動原件促使該基因廣泛傳播，從而給臨床抗感染治療帶來更大困難，應(yīng)該引起高度重視。

2.2 lsa(E)多重耐藥基因簇

深入研究發(fā)現(xiàn)，lsa(E)基因主要存在于多重耐藥基因簇中：aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp，該基因簇通常含有多個耐藥基因，分別為介導(dǎo)氨基糖苷類抗生素耐藥的基因aadE和spc，林可酰胺-截短側(cè)耳素-鏈陽菌素A類的耐藥基因 lsa(E)，介導(dǎo)林可酰胺類耐藥的基因lnu(B)以及轉(zhuǎn)座酶tnp[10,11,15]。運用overlapping PCR的方法對 lsa(E)陽性菌株進行基因簇篩查，結(jié)果顯示，96.6% (28/29)的菌株均含有多重耐藥基因簇中的aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp區(qū)域，僅有一株菌含有l(wèi)sa(E)基因，但不含該基因簇，4個overlapping PCR反應(yīng)均為陰性，該菌株分離自養(yǎng)殖場的地面環(huán)境中，耐藥譜為PEN-TET-SXT-CLI-CIP-LEV-MXF，且對慶大霉素和左氧氟沙星中介耐藥，而對苯唑西林、頭孢噻吩、頭孢西丁、克拉霉素、喹奴普汀-達福普汀和利奈唑胺敏感。

aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp基因簇較為保守，在目前已經(jīng)報道的研究中，除豬丹毒桿菌外，該基因簇在其他多種病原菌中穩(wěn)定存在[10～12,15]，可能是由于該序列中不含插入序列，因此不易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，同時該基因簇可能通過質(zhì)粒實現(xiàn)種內(nèi)及種間交換，從而加劇不同種屬間耐藥基因的相互傳播。而使用該基因簇介導(dǎo)的氨基糖苷類、林可酰胺、截短側(cè)耳素、鏈陽菌素A類抗生素中的任意一種均可對該基因簇產(chǎn)生選擇性壓力，促進其傳播擴散，因此，需加強對含有多重耐藥基因簇菌株的監(jiān)控。

2.3 lsa(E)基因陽性菌株對抗生素的耐藥情況

對分離出的29株lsa(E)基因陽性的金葡菌進行藥敏實驗，耐藥情況見表 2。大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類和磺胺類抗生素是養(yǎng)殖場常用抗生素，也是臨床常用的抗葡萄球菌感染藥物，本研究中，29株lsa(E)基因陽性金葡菌對克拉霉素、克林霉素和復(fù)方新諾明的耐藥率分別為93.1%、100.0%和100.0%。其次，對慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星及莫西沙星的耐藥率均大于70%，沒有發(fā)現(xiàn)有對苯唑西林、喹奴普汀/達福普汀和利奈唑胺耐藥的金葡菌。

Cui等[16]人對陜西、河北、四川、湖北地區(qū)分離的豬源MRSA進行了抗生素敏感性檢測，結(jié)果顯示，分離獲得的菌株對環(huán)丙沙星、克林霉素、頭孢西丁、慶大霉素及四環(huán)素普遍耐藥，未發(fā)現(xiàn)有對利奈唑胺耐藥的菌株。

李君等[15]人研究表明上海、寧夏、河南及山東的豬源lsa(E)基因陽性MRSA主要對四環(huán)素(99.6%)、紅霉素(97.0%)、喹奴普汀/達福普汀(97.0%)以及慶大霉素(80.4%)呈現(xiàn)出較高耐藥，普遍的高耐藥應(yīng)引起我們不斷重視。而且，越來越多的研究表明，豬和豬肉可以作為細菌轉(zhuǎn)移的重要載體，通過食物鏈將養(yǎng)殖場的細菌以及其攜帶的耐藥性向下游的屠宰場、市場傳播[17,18]，進而對食品安全和人類健康帶來了一定嚴重的威脅。

表2 金黃色葡萄球菌對抗生素的藥敏結(jié)果Table 2 Drug susceptibility testing of S. aureus isolates

2.4 lsa(E)基因陽性菌株的多重耐藥分析

金葡菌對九大類抗生素的多重耐藥情況見表 3。定義菌株對三大類及以上抗生素耐藥的菌為多重的耐藥菌。

表3 金黃色葡萄球菌多重耐藥分析Table 3 Multidrug drug resistance analysis for S. aureus isolates

結(jié)果表明，養(yǎng)殖場中29株菌均為多重的耐藥菌，而且耐七大類抗生素的菌株有22株，占比75.9%，耐藥譜主要為PEN-GEN-TET-CLA-SXT-CLI-CIP-MXF。

多重耐藥率達到100.0%，與樊潤等[19]人對河南省豬源MRSA分離株的多重耐藥率相同。另一項研究[20]表明我國河北、陜西、湖北和四川的生豬養(yǎng)殖場或屠宰場金葡菌的主要耐藥表型為 CIP-CLI-ERY-FOXGEN-TET-CHL和 CIP-CLI-ERY-FOX-GEN-TET。金葡菌的流行擴散對食品安全和人們健康有著不可估量的潛在威脅，而多重耐藥是一個長期存在的問題，藥物壓力造成細菌的選擇性耐藥，因此，應(yīng)不斷加大對動物源食品耐藥菌的監(jiān)控，尤其是加強對多重耐藥基因和基因簇的監(jiān)控，降低食物鏈轉(zhuǎn)移多重耐藥基因的風(fēng)險。

3 結(jié)論

3.1 本研究分離的豬源金葡菌中，均含有能介導(dǎo)細菌對林可胺類、截短側(cè)耳素及鏈陽菌素A類耐藥的lsa(E)基因，運用overlapping PCR擴增其多重耐藥基因簇：aadE-spc-lsa(E)-lnu(B)-tnp，陽性率為96.6%，僅有一株菌含有 lsa(E)基因，但不含該基因簇。該多重耐藥基因簇較為保守，不易發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，這是加劇不同種屬間耐藥基因相互傳播的重要原因。

3.2 29株lsa(E)基因陽性的金葡菌對15種藥物表現(xiàn)出不同的耐藥性。對常用抗生素克拉霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星及莫西沙星的耐藥率均大于70%，耐藥情況嚴峻，沒有對苯唑西林、喹奴普汀/達福普汀和利奈唑胺耐藥的金葡菌，說明藥物壓力造成了細菌的選擇性耐藥。

3.3 29株菌均為多重耐藥菌，多重耐藥率達到100.0%，耐七大類抗生素的菌株占比75.9%，耐藥譜主要為PEN-GEN-TET-CLA-SXT-CLI-CIP-MXF，這對動物和人類臨床治療在抗生素的選擇上有一定的指導(dǎo)作用。