人參皂苷Rb1通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)

朱志揚(yáng)，葛然，楊露露

細(xì)菌感染導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起多器官功能衰竭是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因之一[1]。其中，細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的膿毒癥心力衰竭是膿毒癥致死的主要原因。大量研究表明：促炎因子白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）以及白介素1β（IL-1β）在LPS誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-4]。近年來大量研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)和調(diào)控中發(fā)揮重要作用。此外有研究指出LPS會(huì)誘導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，進(jìn)而介導(dǎo)下游炎癥因子的高表達(dá)并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[5-7]。雖然針對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)有了大量研究，但是針對(duì)其仍沒有有效的藥物用于治療LPS誘導(dǎo)的心肌損傷。

最近，一種從中藥材三七和人參分離出的活性分子人參皂苷Rb1被報(bào)道能夠通過調(diào)控血脂代謝和炎癥反應(yīng)減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[8]。此外，還有大量研究表明Rb1可以通過抑制心肌肥大、心肌纖維化及心肌重塑有效緩解擴(kuò)張性心肌癥的發(fā)展[9-11]。然而，人參皂苷Rb1在LPS誘導(dǎo)的心肌損傷中潛在的保護(hù)作用及其分子機(jī)制仍沒有研究。本次研究將通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥模型探索人參皂苷Rb1在其中的保護(hù)功能及作用機(jī)制。現(xiàn)研究報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞本次研究使用的H9C2心肌細(xì)胞系購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，在實(shí)驗(yàn)室按說明書指導(dǎo)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存等工作，用于實(shí)驗(yàn)的H9C2心肌細(xì)胞狀態(tài)良好。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑基因（IL-6，IL-1β，TNF-α，GAPDH）引物購(gòu)于擎科生物科技公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；IL-6，IL-1β，TNF-α炎癥因子ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；蛋白裂解液購(gòu)于上海翊圣公司；LPS購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于生工生物；p-AKT，AKT蛋白抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司；PI3K抑制劑wortmannin購(gòu)于美國(guó)selleck公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建及分組H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在6孔板內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞增殖到80%時(shí)，提前1 h加100 μM人參皂苷Rb1 PBS溶液，其它組加等體積PBS溶液；隨后將溶于PBS溶液的LPS加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，LPS終濃度為1 μg/ml，對(duì)照組加等體積PBS溶液，2 h后收集細(xì)胞樣本。PI3K抑制劑wortmannin使用終濃度為1 μΜ，使用方法與Rb1一致。將H9C2心肌細(xì)胞分為3組用于實(shí)驗(yàn)，分別為對(duì)照組，LPS組，LPS+人參皂苷Rb1或LPS+wortmannin組。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR（real time-qPCR）利用Trizol試劑提取各組H9C2心肌細(xì)胞的總RNA，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè) IL-6，IL-1β，TNF-α三個(gè)炎癥因子mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列，見表1。所有樣本檢測(cè)均需設(shè)置陰性對(duì)照，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組ΔΔCt值，將對(duì)照組一個(gè)樣本ΔΔCt值設(shè)為1，其余實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比變化倍數(shù)。

1.2.3 炎癥因子ELISA檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞上清液。使用IL-6，IL-1β，TNF-α炎癥因子ELISA檢測(cè)試劑盒，根據(jù)說明書操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞上清中各炎癥因子的表達(dá)量。

1.2.4 H9C2心肌細(xì)胞蛋白提取6孔板培養(yǎng)的單層H9C2心肌細(xì)胞，首先棄去培養(yǎng)基后并用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗2遍，6孔板每孔加入100 μl的蛋白裂解液（添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑），用細(xì)胞刮刀將其刮下并收集到1.5 ml EP管中。充分裂解后，12 000 g，4℃離心20 min，取上清到新的EP管中，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)將蛋白樣品配制成1×Loading Buffer蛋白溶液，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離全蛋白樣品；電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，半干轉(zhuǎn)100V恒壓轉(zhuǎn)移0.5 h；5%脫脂牛奶PBS-T溶液封閉2 h；按說明書比例稀釋一抗并過夜孵育；PBS-T溶液洗膜并孵育相應(yīng)的二抗，室溫下1 h；最后充分洗膜完成后，使用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光成像。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（One-Way ANONA）分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rb1抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)為驗(yàn)證Rb1在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，利用qPCR檢測(cè)了IL-6，IL-1β，TNF-α促炎因子的mRNA表達(dá)水平（圖1）；并用ELISA試劑盒檢測(cè)了各組細(xì)胞上清IL-6，IL-1β，TNF-α促炎因子的蛋白表達(dá)（表2）。結(jié)果顯示LPS可以誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞IL-6（9.86±0.173，62.31±5.32），IL-1β（6.23±0.127，37.68±4.45），TNF-α（7.92±0.168，42.55±3.56）促炎因子的mRNA和蛋白水平增加（P＜0.001），而人參皂苷Rb1可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的IL-6（3.27±0.075，8.45±0.92），IL-1β（1.91±0.043，6.41±1.44），TNF-α（2.98±0.101，7.55±1.56）促炎因子mRNA和蛋白水平的增加（P＜0.001）。這一結(jié)果表明人參皂苷Rb1可以抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

2.2 人參皂苷Rb1抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的激活為了探究人參皂苷Rb1抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了PI3K/AKT信號(hào)通路的活化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS可以導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路的活化（2.15±0.184，P＜0.001），而人參皂苷Rb1可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的p-AKT（0.78±0.023，P＜0.001）的激活（圖2）。這一結(jié)果表明PI3K/AKT信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中被過度激活，而且人參皂苷Rb1可以顯著抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。

圖1 各組H9C2細(xì)胞IL-6，IL-1β，TNF-α促炎因子的mRNA表達(dá)水平

表2 各組H9C2細(xì)胞上清IL-6，IL-1β，TNF-α促炎因子的蛋白水平（±s）

表2 各組H9C2細(xì)胞上清IL-6，IL-1β，TNF-α促炎因子的蛋白水平（±s）

注：IL-6：白介素-6；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；LPS組與對(duì)照組比較，aP＜0.001； LPS+Rb1組與LPS組比較，bP＜0.001

Pro-inflammatory factor Control LPS LPS+Rb1 IL-1β（pg/mL） 2.55±0.56 37.68±4.45a 6.41±1.44b IL-6（pg/mL） 3.12±0.82 62.31±5.32a 8.45±0.92b TNF-α（pg/mL） 4.55±0.56 42.55±3.56a 7.55±1.56b

2.3 人參皂苷Rb1通過PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)為了進(jìn)一步探究PI3K/AKT信號(hào)通路的激活是否在人參皂苷Rb1保護(hù)心肌炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，我們使用PI3K特異性抑制劑Wortmannin特異性抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，以確定PI3K/AKT信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。

結(jié)果表明Wortmannin可以明顯抑制PI3K/AKT信號(hào)通路（2.21±0.218，P＜0.001）的活化（圖3），并顯著降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞IL-6（7.98±1.23，P＜0.001），IL-1β（5.21±0.98，P＜0.001），TNF-α（9.28±0.56，P＜0.001）促炎因子的表達(dá)（表3）。這一結(jié)果表明PI3K/AKT信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而人參皂苷Rb1則通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路緩解LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

圖2 各組心肌細(xì)胞p-AKT及AKT的表達(dá)情況及p-AKT/AKT比值

圖3 各組心肌細(xì)胞p-AKT及AKT的表達(dá)情況及p-AKT/AKT比值

表3 ELISA檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞上清IL-6，IL-1β，TNF-α促炎因子的蛋白水平（±s）

表3 ELISA檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞上清IL-6，IL-1β，TNF-α促炎因子的蛋白水平（±s）

注： IL-6：白介素-6；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；LPS組與對(duì)照組比較，aP＜0.001； LPS+Wortmannin組與LPS組比較，bP＜0.001

P r o-i n f l a m m a t o r y f a c t o r C o n t r o l L P S組 L P S+W o r t m a n n i n組I L-1 β（p g/m L） 1.9 5±0.3 9 3 4.2 3±2.1 5 a 5.2 1±0.9 8 b I L-6（p g/m L） 4.6 1±0.9 2 7 1.1 2±4.9 6 a 7.9 8±1.2 3 b T N F-α（p g/m L） 5.6 4±0.7 4 5 3.2 9±5.8 7 a 9.2 8±0.5 6 b

3 討論

LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌功能紊亂是細(xì)菌感染導(dǎo)致患者發(fā)病和死亡的主要原因之一[1,12,13]。近年來，大量研究報(bào)道了LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞過表達(dá)IL-6，IL-1β，TNF-α等促炎因子，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞死亡的機(jī)制和功能研究[4,14]。最近一項(xiàng)研究表明LPS可以通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)促炎因子的生成和分泌，導(dǎo)致心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及心肌功能紊亂[15,16]。在本研究中，利用PI3K特異性抑制劑探究了PI3K/AKT信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥中的功能，而且結(jié)果證實(shí)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中確實(shí)存在PI3K/AKT信號(hào)通路的過度激活。PI3K/AKT已被大量研究證實(shí)其在介導(dǎo)多種調(diào)控細(xì)胞增殖和生存的信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5,6,17]。除此之外，還有更多的研究發(fā)現(xiàn)包括MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等在LPS誘導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用[3,14]。然而，針對(duì)這些發(fā)現(xiàn)，目前仍沒有有效的藥物可以用于LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

最近，越來越多的研究表明傳統(tǒng)中草藥中的天然產(chǎn)物在藥物開發(fā)中的重要地位，如三七和人參在治療心血管疾病中的作用的重視[10]。人參皂苷Rb1是從三七和人參中分離得到的活性小分子物質(zhì)[9-11]，最近報(bào)道指出其在新生大鼠原代心肌細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用[18]。但是人參皂苷Rb1在心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用和分子機(jī)制仍未研究和報(bào)道過。鑒于此，我們通過建立LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，用以探究人參皂苷Rb1在心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的功能及作用機(jī)制。通過實(shí)驗(yàn)表明，人參皂苷Rb1的確可以降低LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中IL-6，IL-1β，TNF-α等促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而減緩心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，人參皂苷Rb1是通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路阻止LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

本研究首次提出并證實(shí)了人參皂苷Rb1在心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的保護(hù)作用，進(jìn)一步研究證實(shí)人參皂苷Rb1通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化減少IL-6，IL-1β，TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平，進(jìn)而阻止LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)探索了人參皂苷Rb1的作用及分子機(jī)制，并為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)提供了新的治療途徑。