人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231三維培養(yǎng)模型的構(gòu)建

彭雪梅，劉永文，張海燕

(1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同037009；2.山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西大同037009)

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，在威脅女性身心健康的惡性腫瘤中位居第一。近年來全球乳腺癌發(fā)病率逐年上升，但死亡率卻呈下降趨勢(shì)，究其原因，主要?dú)w功于對(duì)乳腺癌的早期篩查和早期治療，另外對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的深入研究以及抗癌新藥的研發(fā)顯著提高了乳腺癌的治療效果。因此探索乳腺癌早期的發(fā)病機(jī)理并尋找癌變?cè)缙诘陌悬c(diǎn)對(duì)乳腺癌的早期診斷和治療具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)的體外研究乳腺癌的方法是將乳腺癌細(xì)胞二維培養(yǎng)(2D)在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，然而2D培養(yǎng)只能使細(xì)胞在平面內(nèi)單層生長(zhǎng)，與體內(nèi)環(huán)境之間存在著較大的生物學(xué)差異，因?yàn)槟[瘤的發(fā)生發(fā)展始終伴隨著與微環(huán)境之間的相互作用，微環(huán)境中諸多因素調(diào)控著腫瘤細(xì)胞最終的命運(yùn)與轉(zhuǎn)歸，并且腫瘤細(xì)胞也會(huì)對(duì)微環(huán)境進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的重塑與馴化。體外2D培養(yǎng)打破了腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，影響基因精確表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞喪失原有的表型及功能[1]。近年來發(fā)展起來的3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立了腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互聯(lián)系，成為體外2D細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之間的關(guān)鍵橋梁[2]。具體來說，3D細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞種植在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或以細(xì)胞外基質(zhì)替代物為生長(zhǎng)支架使細(xì)胞在保證活力和增殖能力的基礎(chǔ)上，迅速貼壁生長(zhǎng)并能夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu)，采用立體結(jié)構(gòu)來模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的體內(nèi)環(huán)境，可以最大程度地模擬腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)所具備的形態(tài)和表型特征，因此該培養(yǎng)技術(shù)正越來越得到廣泛接受和使用[3-8]。

常規(guī)的乳腺癌細(xì)胞3D培養(yǎng)是直接將乳腺癌細(xì)胞種于鋪有人工基質(zhì)膠的支架材料，MDA-MB-231采用這種方法構(gòu)建的3D模型是一種放射管狀模型[9]。本研究為了在完全相同的條件下比較MDA-MB-231與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A的3D形態(tài)差異，因此MDA-MB-231采用的是與MCF-10A相同的3D培養(yǎng)體系，結(jié)果意外的發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231形成的是一種接近體內(nèi)的球形結(jié)構(gòu)，并且這種球形結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出去極化和過度增殖的特征，這是公認(rèn)的乳腺癌的標(biāo)志。表明該3D培養(yǎng)模型能有效模擬乳腺癌體內(nèi)的形態(tài)特征，可為深入闡明乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231惡化轉(zhuǎn)移及相關(guān)機(jī)制等研究提供有力的研究工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系和試劑

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，0.25%胰蛋白酶 (含 EDTA，HyClone)，DMEM/F12 培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清 (FBS，Gibco)，馬血清（HS，Invitro?gen），青鏈霉素 (P/S，HyClone)，Human EGF（Pepro?Tech），霍亂毒素（Sigma），皮質(zhì)醇（Sigma），人胰島素（Sigma），DAPI（Boehringer Manheim），GM130（BD），Laminin-5(Abcam)，Alexa Fluor? 633 Don?key Anti-Rabbit和 Alexa Fluor? 555 Goat Anti-Mouse均購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 儀器設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermofisher），激光共聚焦顯微鏡（Lica），差相倒置熒光顯微鏡Ti/S（NIKON），超純水儀（Milipore），搖床（其林貝爾實(shí)驗(yàn)室儀器），8孔小室（Thermofisher）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231體外培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL青/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，隔日定期換液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，按1∶3比例進(jìn)行體外傳代培養(yǎng) (37°C，5%CO2)。

人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A體外培養(yǎng)于含5%HS，100 U/mL青/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，外加細(xì)胞因子添加劑（EGF、Hydrocortisone、Chol?era toxin和Insulin），隔日定期換液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，按1∶5比例進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)(37°C，5%CO2)。

1.4 構(gòu)建乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 3D培養(yǎng)模型

MDA-MB-231采用與MCF-10A相同的3D培養(yǎng)體系[10]，只有血清不同，其他添加的生長(zhǎng)因子種類和濃度均一致。具體來講，8孔小室提前預(yù)冷，在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取40 μL Matrigel頂住槍頭底部均勻移動(dòng)平鋪于小室底部，鋪好迅速放37℃培養(yǎng)箱15～30 min，時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則Matrigel會(huì)過干脫水。期間制備單細(xì)胞混懸液：細(xì)胞生長(zhǎng)至75%連接，加Try/EDTA 1mL，37℃，消化細(xì)胞，輕敲皿壁，避免一次大片脫落，將終濃度1×104/mL的細(xì)胞混懸于3D培養(yǎng)基中，即DMEM/F12中含2%Matrigel，2%FBS，1%PS，5 ng/mL EGF，0.25μg/mL ydrocortisone，50 ng/mL Cholera toxin,5 μg/mL In?sulin中，靜置5 min；待細(xì)胞沉靜下來置于37℃培養(yǎng)箱。每2 d用3D培養(yǎng)液換液1次，培養(yǎng)10 d進(jìn)行confocol檢測(cè)。

1.5 3D球免疫熒光染色

培養(yǎng)到第10天的3D球用PBS洗1次；立即用2%的多聚甲醛室溫固定20 min；接著0.5%Triton X-100在4°C破膜10 min；室溫?fù)u床上PBS洗3次，10 min/次；10%山羊血清室溫封閉1 h；一抗（1∶150）4°C孵育過夜；室溫?fù)u床上PBS洗3次，20 min/次；Alexa熒光二抗室溫孵育（1∶200）40 min；室溫?fù)u床上PBS洗3次，20 min/次；用含DAPI的封片劑封片，室溫干燥過夜。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

在激光共聚焦顯微鏡下（Leica,TCS SP8，德國(guó)）隨機(jī)選取小室的4個(gè)視野檢測(cè)3D球，每個(gè)視野下檢測(cè)至少25個(gè)，然后根據(jù)3D球的形態(tài)差異或者空腔與否記錄3D球數(shù)目，用Excel或者Origin生物軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 改進(jìn)前后兩種不同三維培養(yǎng)模型下MDA-MB-231形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

我們首先比較了在2種不同的3D培養(yǎng)模型下（培養(yǎng)體系見表1）MDA-MB-231生長(zhǎng)分化10 d的形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在將細(xì)胞直接種于底部鋪有Matrigel的培養(yǎng)皿所建立的3D培養(yǎng)模型下，MDAMB-231形成的是一種放射管狀結(jié)構(gòu)（圖1-a）；而在本研究改進(jìn)的3D培養(yǎng)模型下，MDA-MB-231形成的是一種球形結(jié)構(gòu)（圖1-b）。顯然，2種不同的培養(yǎng)方式直接影響了MDA-MB-231的3D形態(tài)。

由于改進(jìn)的MDA-MB-231 3D培養(yǎng)體系與MCF-10A 3D培養(yǎng)體系基本一致，因此我們進(jìn)一步比較了兩者的3D表觀形態(tài)發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231球體與MCF-10A腺泡的表觀形態(tài)有明顯的差異，MCF-10A腺泡形態(tài)規(guī)則，外圍無分支結(jié)構(gòu)，在相差顯微鏡下通過光的不同面折射可呈現(xiàn)腺泡中間凹陷形成的中空的腔體結(jié)構(gòu)（圖1-c）；而MDA-MB-231球體外圍不規(guī)則有分支，球體中心細(xì)胞密集呈凸起狀（圖1-b），更接近于體內(nèi)乳腺癌的形態(tài)特征。

2.2 MDA-MB-231球體中心是一個(gè)無空腔的實(shí)體球

圖1 不同3D培養(yǎng)模型下的MDA-MB-231和MCF-10A形態(tài)比較

乳腺腺泡空心腔結(jié)構(gòu)是上皮細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)，在正常的MCF-10A乳腺上皮形態(tài)發(fā)生過程中，腺泡會(huì)形成中心管腔結(jié)構(gòu)，而在乳腺癌組織中幾乎都是腔體填滿的結(jié)構(gòu)[11]。基于MDA-MB-231球體與MCF-10A腺泡在表型形態(tài)上的顯著差異，我們進(jìn)一步檢測(cè)了它們?cè)?D培養(yǎng)10 d時(shí)的空心腔形成情況。在confocal下隨機(jī)任選一個(gè)視野沿Z軸方向從頂?shù)降讓忧?層，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-10A腺泡的赤道軸切面（最中間層）是一個(gè)空心腔結(jié)構(gòu)（圖2，上），而MDA-MB-231球體層切的每一層包括赤道軸切面都沒有空心腔的出現(xiàn)，整個(gè)球體是一個(gè)中心填滿細(xì)胞的實(shí)心結(jié)構(gòu)（圖2，下），具備了體內(nèi)乳腺癌的基本性狀。由此可見，該3D培養(yǎng)模型可以更好地模擬MDA-MB-231體內(nèi)的形態(tài)。

圖2 MCF-10A腺泡（上）和MDA-MB-231球體（下）confocal系列層切（Scale bar,75 μm）

2.3 體外3D培養(yǎng)的MDA-MB-231實(shí)心球呈現(xiàn)極性紊亂的特征

頂?shù)撞繕O性的建立是空心腔形成必不可少的條件之一。MCF-10A體外3D培養(yǎng)至第6天，腺泡內(nèi)的細(xì)胞會(huì)逐漸發(fā)生頂?shù)撞繕O化，到第8天時(shí)，一個(gè)腺泡中的細(xì)胞已經(jīng)明顯分化成2種不同的類群：一類是發(fā)生極化的、緊密有規(guī)則排列構(gòu)成腺泡外層的一群細(xì)胞，它們和細(xì)胞外基質(zhì)直接相連；另一類是未發(fā)生極化的、在腺泡內(nèi)層的一群細(xì)胞，它們和細(xì)胞外基質(zhì)失去了連接，逐漸發(fā)生失巢凋亡，從而形成空腔結(jié)構(gòu)。細(xì)胞失去極性，標(biāo)志著細(xì)胞和組織癌變[12]?；贛DA-MB-231在3D培養(yǎng)下形成的非空腔結(jié)構(gòu)，推測(cè)在該3D模型下MDA-MB-231形成了去極化的結(jié)構(gòu)。

我們通過2個(gè)關(guān)鍵極性標(biāo)記（GM130和Lam?inin-5）檢測(cè)MDA-MB-231球的極性形成情況，其中，GM130是一個(gè)分子量為130 KD的順式高爾基體的基質(zhì)蛋白，文獻(xiàn)報(bào)道高爾基體的極性組織和定位對(duì)極性的形成和維持是必不可少的，因此GM130的頂端定位常被用于檢測(cè)頂部極性的形成[13]。Lam?inin-5是乳腺腺泡的基底膜成分之一，MCF10A存積基部Laminin-5的能力是體內(nèi)乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的一個(gè)主要特征，同時(shí)也是基底上皮層正確組織和極性形成的標(biāo)志[14]。

圖3 頂部極性標(biāo)記GM130在3D球中的極性定位（Scale bar,25 μm）

我們將MDA-MB-231和MCF-10A 3D培養(yǎng)10 d進(jìn)行腺泡固定和GM130免疫熒光染色，同時(shí)用DA?PI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，利用Confocal顯微鏡對(duì)腺泡進(jìn)行層切，在赤道軸切面進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-10A腺泡分化成了明顯的極化結(jié)構(gòu)，GM130一律規(guī)則的排列在細(xì)胞核的前面朝向空腔頂端定位（圖3，左）；形成鮮明對(duì)比的是，MDA-MB-231球體中GM130呈無規(guī)則分布，并未表現(xiàn)出頂端極性定位（圖3，右）。

同樣的方法對(duì)3D球進(jìn)行底部極性標(biāo)記Lam?inin-5的免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-10A腺泡中Laminin-5規(guī)則的存積于腺泡基底部，整齊干凈的包圍著腺泡，表現(xiàn)出腺泡正常的基底部極性（圖4，左）；而6 MDA-MB-231球體Laminin-5以一種無極性的形式過度地存積于球體外圍并逐漸向球體內(nèi)部?jī)?nèi)滲，有研究表明Laminin-5內(nèi)滲有助于球體內(nèi)部細(xì)胞的存活，從而形成了無極性的實(shí)心球（圖4，右）。

圖4 底部極性標(biāo)記Laminin-5在3D球中的極性定位（Scale bar,10 μm）

3 討論

本研究基于乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞在相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行比較分析為契機(jī)，借鑒MCF-10A的3D培養(yǎng)體系進(jìn)行MDA-MB-231的3D培養(yǎng)，結(jié)果意外的發(fā)現(xiàn)了一種不同于以往文獻(xiàn)報(bào)道的MDA-MB-231的3D培養(yǎng)模型，主要改進(jìn)之處在于將MDA-MB-231首先包裹于Matrigel人工基質(zhì)膠，再種于底部鋪有Matrigel的培養(yǎng)皿中，另外，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不僅有FBS，同時(shí)還添加了EGF、霍亂毒素、胰島素及皮質(zhì)醇等細(xì)胞生長(zhǎng)分化所需的添加劑，在這個(gè)3D培養(yǎng)體系下MDA-MB-231生長(zhǎng)10 d形成的是一種實(shí)心球體，相比于以往直接將MDA-MB-231鋪于Matrigel包被的培養(yǎng)皿上所形成的放射管狀結(jié)構(gòu)，該模型更接近實(shí)體內(nèi)乳腺癌實(shí)體囊泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞極性指的是細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上的空間差異，細(xì)胞極性的形成與維持對(duì)生物體執(zhí)行特定功能非常重要，包括組織發(fā)育和重建、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞轉(zhuǎn)移等[15]。絕大多數(shù)細(xì)胞來源于上皮細(xì)胞，頂?shù)撞繕O性是正常上皮細(xì)胞特有的屬性，一旦細(xì)胞失去極性，腺泡失去空腔以及細(xì)胞無限紊亂生長(zhǎng)，就寓意著細(xì)胞和組織發(fā)生癌變。因此，細(xì)胞極性是抵抗癌癥的主要守門員，去極化是癌細(xì)胞在體內(nèi)的首要特征之一。本研究發(fā)現(xiàn)相比較于MCF-10A腺泡規(guī)則的GM130和Laminin-5極性定位，MDA-MB-231實(shí)心球呈現(xiàn)的是一種GM130無規(guī)則分布且Laminin-5向球體中心內(nèi)滲的極性紊亂的狀態(tài)。呈現(xiàn)出乳腺癌的去極化特征，因此本研究建立的MDA-MB-231 3D培養(yǎng)模型能夠很好的模擬乳腺癌在體內(nèi)的真實(shí)形態(tài)，可為深入闡明乳腺癌細(xì)胞惡化、轉(zhuǎn)移以及耐藥發(fā)生相關(guān)機(jī)制和后續(xù)藥物靶向治療等研究提供可靠實(shí)用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>