探討用分型方法檢測溯源副溶血性弧菌

李玉 徐艷霞 句立言 孫紅 潘玉輝 孫婷媛

副溶血性弧菌（VP）是在被污染或者攜帶傳播疾病食品中存在的病原菌，和食品安全具有緊密的聯(lián)系，因此政府和社會對其比較關(guān)注[1-2]。溯源是對病原菌的來源，親緣關(guān)系等進行分析，對流行性進行預測，提前進行防控的手段。此次我們對血清分型、PFGE和ERIC-PCR等方式的分型情況開展了分析研究。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

此次收集了食品來源VP607株，患者和食物中毒VP480株，對這些菌株進行了血清分型，并采取了PFGE基因分析和ERIC基因分析，對感染源追蹤，了解其溯源和親緣關(guān)系等情況。

1.2 方法

參照美國PulseNet PFGE標準化方法[3-4]，（1）制膠塊：2 ml細胞懸浮液（CSB），挑取新鮮培養(yǎng)物，均勻懸濁，使菌液濁度至20%透射值。將混合物加入模具孔中制成膠塊，4℃ 10 min冷卻。（2）蛋白消化：3 ml細胞裂解液（CLB）溶液加入15 μl蛋白酶K（20 mg/ml）（最終濃度0.1 mg/ml），用模具梳子將膠塊直接取出，投入CLB中54℃水浴2 h。棄液，涼至室溫，加3 ml TE，置4℃保存。（3）酶切。（4）制膠：將酶切后的樣品膠置于樣品梳上，擺放到模具上。（5）電泳：電壓6 V/cm，電泳時間19 h，脈沖參數(shù)（2～10 s，13 h）：（20～25 s，6 h），電泳溫度14℃。（6）染色：電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用0.5 μg/ml的Goldview染色30 min，去離子水脫色30 min。（7）讀膠：用凝膠成像儀讀膠分析。

2 結(jié)果

來自食品來源的607株菌株共分成了10個血清群，有30株無法分型的海產(chǎn)品分離株VP，這可能是新的血清群，分型率是94.64%，0：6群和0：5群為流行優(yōu)勢株；來自患者和食物中毒的480株菌株分成了6個血清群，0：3群為流行優(yōu)勢株。海產(chǎn)品VP分成了PFGE型29個，患者和食物中毒菌株P(guān)FGE型為12個。261株不同來源的VP分出42個ERIC基因型。有141株是海產(chǎn)品中的，有60例株是腹瀉患者的，食品和環(huán)境VP的ERIC-PCR多態(tài)性電泳條帶。

3 討論

VP菌株血清分型和許多的胃腸道急性疾病有緊密聯(lián)系[5-6]，VP是上世紀末在世界范圍內(nèi)流行的優(yōu)勢菌株，在現(xiàn)今社會也有很高的流行度，其感染和蔓延能力受到了廣泛的關(guān)注。海產(chǎn)品分離VP優(yōu)勢株和患者分離優(yōu)勢株存在差異性，致病風險情況還有待實驗驗證。海產(chǎn)品有可能導致VP食品源的爆發(fā)和擴散，需要引起我們的關(guān)注。此次研究有30株無法分型的海產(chǎn)品分離株VP，這可能是新的血清群。表明VP血清分型具有局限性。

PFGE分型由Schwarts和Cernter建立，通過改變電場方向來分析DNA分子[7-8]。分型過程需要對細菌染色體結(jié)構(gòu)進行檢測，其準確度高，穩(wěn)定性高，對菌株微小差異能夠顯示。此次研究中我們認為海產(chǎn)品分離株VP大部分都不會導致食物中毒和腹瀉。

ERIC-PCR分型是通過腸桿菌科和弧菌屬細菌的短重復序列在不同菌種上的差異性進行分析。ERIC-PCR是對細菌基因分型比較有效的方式，對菌株的親緣關(guān)系和溯源具有優(yōu)勢?？梢匝芯烤觊g致病能力的關(guān)聯(lián)性。

總而言之，三種分型方式對于VP分型都有效果，各有特點。血清分型能夠?qū)P流行優(yōu)勢型進行溯源，但分辨率低，費時，復雜，對菌株關(guān)系無法確定，無法溯源。PFGE和ERIC-PCR對VP進行有效分型，也能夠確定菌株間的親緣關(guān)系，對致病性相關(guān)性研究有幫助。推介兩種或多種分型方式共同使用，可以更快更準確的進行分型，防控VP導致的腹瀉和食物感染事件。

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