藏獒犬白介素18基因的克隆及原核表達(dá)

宋世斌，胡永浩，何 強(qiáng)，敬淑燕 ，仝保全

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院;3. 蘭州原生獒園)

藏獒，又名藏狗、番狗、羌狗。原產(chǎn)于我國(guó)雪域高原，廣泛分布于青藏高原海拔3 000～5 000 m的高寒牧業(yè)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)，如西藏、青海、甘肅、四川等地，是經(jīng)過藏族牧民的嚴(yán)格選擇和培育而形成的優(yōu)秀犬品種，是我國(guó)唯一的一個(gè)大型犬種，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，被列為世界名犬之一。隨著人們生活水平日益提高，犬類動(dòng)物在人類的生活中越來越占據(jù)重要的部分，如作為伴侶動(dòng)物、警犬、救護(hù)犬等，但是狂犬病、犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱和犬腺病毒病等各種病毒性疾病嚴(yán)重危害著犬的健康和生存，也困擾著我國(guó)的養(yǎng)犬業(yè)，加之各種原因造成的免疫程序失敗，使病毒病的預(yù)防和治療顯得尤為重要。白細(xì)胞介素18(Interleukin-18,IL-18)最初名為干擾素誘生因子或白細(xì)胞介素1γ，是一種重要的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)因子。1995年日本學(xué)者首次從中毒性休克的鼠肝臟中分離并克隆出該因子。現(xiàn)已了解它有重要的免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)功能；它可誘生IFN-γ及Fasl表達(dá)，增強(qiáng)IL-2和GM-CSF的活性；可與許多細(xì)胞因子相互作用，IL-18 mRNA在多種器官、組織、細(xì)胞中均可測(cè)到。在抗腫瘤、抗感染及免疫調(diào)節(jié)中起著積極的作用，在許多疾病的基礎(chǔ)性研究和臨床應(yīng)用中有重要前景。國(guó)內(nèi)已克隆了犬、豬、牛、人、雞等哺乳動(dòng)物的IL-18，藏獒犬的還未見報(bào)道，因此本研究克隆并成功的表達(dá)了該基因，為后續(xù)藏獒犬的蛋白的功能、生物學(xué)活性及抗病毒藥物及免疫預(yù)防研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Trizol Reagent、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自invitrogen公司；淋巴細(xì)胞分離液、Phenol Chlorform購(gòu)自sigam；dNTP、RNA酶抑制劑、Agarose Gel DNA Extraction Kit、DNA 2000marker 等均購(gòu)自TaKaRa公司；PBS、D-Hanks洗液、RPM1640培養(yǎng)液、3.8的%檸檬酸鈉溶液由筆者所在的實(shí)驗(yàn)室配制；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

藏獒犬來源于蘭州原生獒園。

1.3 細(xì)胞因子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及總RNA提取方法

1.3.1 藏獒血外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)的分離與刺激誘導(dǎo) 無菌采取藏獒的新鮮外周血，以3.8%檸檬酸鈉抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分出PBMC，用D-Hank’S液洗滌細(xì)胞，再用完全的1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml。將細(xì)胞現(xiàn)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，然后加入LPS 5 ug/mL+PHA 2 ug/ mL，繼續(xù)在50 mL/LCO2培養(yǎng)箱中37℃刺激誘導(dǎo)24 h。

1.3.2 PBMC總RNA提取 在PBMC誘導(dǎo)6 h、12 h、24 h不同時(shí)段收獲細(xì)胞，用PBS洗1次，然后用Trizol Reagent從PBMC中提取總RNA，并用電泳觀察所提RNA的完整性后置-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因克隆方法

1.4.1 引物的設(shè)計(jì) 參照GenBank上已登錄的犬IL-18(NM001003305)序列，利用PrimerSelect軟件和Oligo軟件設(shè)計(jì)了引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

基因克隆引物：上游引物：5ˊ-ATGGCTGCTAACCTAATAGAAG -3ˊ

下游引物：5ˊ-CTAGCTCTTGTTTTGAACAGTG -3ˊ

表達(dá)引物：上游引物：5ˊCGGGATCC ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAˊ-3ˊ

上游引物：5ˊCGGAATCC TCA AGC TTG CCA AAG TAC AT -3ˊ

1.4.2 RT反應(yīng)條件的選擇 將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，在經(jīng)DEPC處理的PCR管中加入模板RNA8 ul，50 pmol/uL Oligo(dT18)1 uL，dNTP 1uL 、DEPC 水總體積12 uL ，混合物65℃溫浴5 min后，迅速置冰上冷卻。后再加入第一鏈合成緩沖液、DTT及RNA核酸酶抑制劑，然后按照試劑盒的invitrongn轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

在RT產(chǎn)物中加入適量的dNTP、PCR buffer和引物，最后補(bǔ)水到50 uL。根據(jù)退火溫度設(shè)計(jì)了如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃50 s，48 ～55 ℃50 s，72 ℃40 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.4.3 基因的克隆及陽性質(zhì)粒的鑒定 按照以上條件進(jìn)行擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物回收后克隆入PGEM-T Easy載體，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和EcoRI酶切鑒定，選取陽性克隆送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.4.4 藏獒白介素18基因的序列分析 采用DNAstar序列分析軟件對(duì)藏獒犬IL-18基因與GenBank中的IL-18基因進(jìn)行序列分析。利用生物信息學(xué)方法對(duì)克隆分子的遺傳進(jìn)化關(guān)系和序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.5 藏獒犬pET-30a-IL-18重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用合成的表達(dá)引物，以pGEM- -IL18質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，利用Hind III和EcoRI限制性內(nèi)切酶雙酶切 PCR產(chǎn)物和Pet-30質(zhì)粒，分別回收、純化目的基因片段和載體片段，再利用T4 DNA連接酶，將IL18基因定向插入pET-30a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含Kan LB培養(yǎng)基，37℃過夜搖菌，提取質(zhì)粒，經(jīng) Hind III 和EcoRI進(jìn)行酶切鑒定后，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a-IL18。

1. 6 藏獒犬pET-30a- IL-18誘導(dǎo)及Western - blot分析

測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-30a-IL18轉(zhuǎn)化BL-21細(xì)胞后，挑取單克隆接種于含Kan+ LB，收集沉淀，超聲破碎儀粉碎細(xì)菌，收集上清和沉淀并分別進(jìn)行電泳；部分經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)行Western bloting檢測(cè)，分析蛋白的表達(dá)情況。用PBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶1000稀釋的鼠抗his IgG(一抗)，室溫作用1h，洗滌3次后，加入1∶8000羊抗鼠HRP IgG 二抗，室溫孵育1h，再用上述方法洗滌后加加入DAB顯色液，均勻滴加到PVDF膜上，顯色。

2 結(jié)果2.1總RNA提取的完整性

提取的總RNA電泳后呈瀑布狀分布，有5S、18S、28S三條帶，說明所提取的總RNA 沒有降解(見圖1)。

圖1 總RNA提取結(jié)果

2.2 基因的克隆

用PHA、LPS誘導(dǎo)PBMC擴(kuò)增出特異的IL-18基因，大小約為58 2bp(見圖2)；在不同時(shí)段表達(dá)的目的基因量不同，在誘導(dǎo)24h的外周血淋巴細(xì)胞中目的基因的表達(dá)量最大。

圖2 IL-18 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 M、.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、沒有誘導(dǎo)的，2,3,4誘導(dǎo)的不同時(shí)間擴(kuò)增的目的產(chǎn)物

2.3 序列測(cè)定及分析

對(duì)序列結(jié)果進(jìn)行分析，所克隆藏獒IL-18基因與參考犬序列的同源性為100%，氨基酸序列的同源性為100%。測(cè)序的藏獒犬IL-18基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖3所示, 藏獒犬IL-18基因的全長(zhǎng)為582 bp, 包含一個(gè)完整閱讀框, 共編碼194個(gè)氨基酸的前體蛋白, N端前36個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽, 成熟蛋白為149個(gè)氨基酸, 推測(cè)其分子量為18.10 KD，等電點(diǎn)為6.112。

圖3 藏獒犬IL-18序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.4 序列的比較分析及進(jìn)化分析

從NCBI上下載家犬、貓、豬、牛、羊、人的IL-18的核酸序列及本研究中所克隆的IL-18核苷酸序列(命名為KeLongzangaoIL-18)，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結(jié)果表明，藏獒的IL-18基因在系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上與家犬的同系，與貓的也較近而與人的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。將所測(cè)的IL-18基因序列與GenBank下載讀取的人和貓、豬、羊、牛、人的IL-18基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比較得出的核苷酸同源性分別為100%、91.2%、91.1%、88.5%、89.3%、84.4%。 ，表明IL-18存在明顯種屬差異性。

圖4 人、藏獒犬及其他動(dòng)物IL-18核苷酸序列繪制進(jìn)化樹

2. 5 pET-30a-IL-18重組質(zhì)粒的鑒定

以質(zhì)粒 pEGM- IL-18為模板， PCR 擴(kuò)增后得到約 477 bp左右的基因片段， 酶切后插入原核表達(dá)載體pET-30a，得到pET-30a- IL-18重組質(zhì)粒。pET-30a質(zhì)粒及PCR片段經(jīng) Hind Ⅲ 和 BamHⅠ酶切后得到約為 4. 7 kb 的載體片段和約477bp 的IL-18基因片段，測(cè)序證實(shí)目的基因ORF準(zhǔn)確插入到載體中 (圖5)。

圖5 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定1. DL2000Marker； 2. EcoRI和 HindIII雙酶切產(chǎn)物；3. PCR產(chǎn)物；

2.6 pET-30a- IL-18重組蛋白表達(dá)情況和 Western bloting 結(jié)果

收集的細(xì)胞經(jīng)超聲處理后SDS-PAGE電泳后(如圖6)，表達(dá)產(chǎn)物大約為25Kd ；Western bloting檢測(cè)結(jié)果pET-30a-IL-18出現(xiàn)約25Kd的目的條帶，說明目的蛋白得到正確表達(dá)(圖7)。

圖6 SDS-PAGE 分析pET-30a- IL18表達(dá)結(jié)果 1、沒有誘導(dǎo)的空載體，2，3超聲的沉淀

圖7 pET-30a- IL18 westbloting結(jié)果1、2 表達(dá)的pET-30a - IL-18表達(dá)的蛋白

3 討論與分析

IL-18是一種新發(fā)現(xiàn)的分布廣泛的細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)功能，其中對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用已受到研究者們的極大關(guān)注，有研究證明在抗微生物感染，尤其是在抗病毒免疫方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。動(dòng)物的研究落后于人類和小鼠，但是近些年來也取得了迅速的進(jìn)展。國(guó)內(nèi)外對(duì)于IL-18 的研究大多圍繞著豬牛羊和禽類等動(dòng)物展開，藏獒犬的還未見報(bào)道。本研究根據(jù)GenBank發(fā)表的犬IL-18基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，利用RT-PCR技術(shù)從誘導(dǎo)的藏獒犬外周血中擴(kuò)增出藏獒犬的IL-18基因，并克隆鑒定；測(cè)序結(jié)果表明本研究中克隆了藏獒犬IL-18完整的閱讀框，大小為582bp，所克隆的基因與參考序列的同源性為100%，這說明IL-18基因較保守。將藏獒犬IL-18基因核苷酸序列與人和其他5種動(dòng)物的IL-18核苷酸序列比對(duì)分析并繪制進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，藏獒犬與犬、貓的親緣關(guān)系較近同源性在91～100%之間；而與牛羊的同源性達(dá)到88～89.3%；相比較與人的較遠(yuǎn)，但是也達(dá)到了84.4%。這也表明IL-18 存在種屬的差異性，親緣關(guān)系越近同源性越高。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、成本低、易于分離純化和放大制備等優(yōu)點(diǎn)。原核表達(dá)系統(tǒng)在基因表達(dá)技術(shù)中占主要地位，是現(xiàn)階段實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的有效途徑。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)，主要以不溶性包涵體形式目的蛋白，僅有極少量以可溶性蛋白形式存在于胞漿中，這反映了原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)外源基因的一般規(guī)律。目的蛋白以不溶性包涵體形式表達(dá)，既是目的基因在宿主細(xì)胞中過度表達(dá)的表現(xiàn)，也是高表達(dá)量目的蛋白不被菌體內(nèi)蛋白酶降解的需要，保證了表達(dá)蛋白的活性及后續(xù)制備及可行性。藏獒犬IL-18基因全長(zhǎng)編碼的194個(gè)氨基酸中，前36個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，本試驗(yàn)中成功的構(gòu)建了去信號(hào)肽的藏獒犬IL-18原核表達(dá)載體、在誘導(dǎo)劑的作用下能夠誘導(dǎo)大量的IL-18表達(dá)，westbloting驗(yàn)證表達(dá)的蛋白是正確的,這對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)重組藏獒犬IL-18具有重要的意義，也為我國(guó)重組基因的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

藏獒犬作為伴侶及觀賞動(dòng)物，在我國(guó)的養(yǎng)殖范圍不斷擴(kuò)大，但是病毒病對(duì)養(yǎng)殖藏獒犬業(yè)影響較大，病毒如細(xì)小病毒、狂犬病毒、犬瘟熱等破壞了犬的免疫系統(tǒng)，出現(xiàn)發(fā)熱發(fā)炎等癥狀。藏獒犬IL-18是一種重要的細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)活性、能誘導(dǎo)NK細(xì)胞、T細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ，還能促進(jìn)T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的細(xì)胞毒及NK細(xì)胞殺傷活性，因而其具有較強(qiáng)的免疫增性，成為免疫佐劑及增強(qiáng)劑研究的熱點(diǎn)，而且在疾病的預(yù)防和治療方面具有很大的潛在的應(yīng)用價(jià)值，值得做更深入的研究。因此犬IL-18可望成為疫苗的一種重要的細(xì)胞免疫佐劑，在提高犬體抗感染力、增強(qiáng)滅活苗或基因工程苗免疫作用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。研究表明，在通常情況下，機(jī)體內(nèi)IL-18表達(dá)量甚微,不可能直接提取純化，只有通過基因工程技術(shù)才能大量生產(chǎn)重組IL-18。顯然,本研究為進(jìn)一步研究和開發(fā)利用IL-18奠定了基礎(chǔ)。