禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞分泌IL-4和IFN-γ的影響

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(1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所, 甘肅 平?jīng)?744000；2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院)

禿瘡花(Dicranostigma leptopodum (Maxim) Fedde，DLF)，又名紅茂草、禿子花、勒馬回(陜西)，為罌粟科禿瘡花屬二年生或多年生草本植物, 主要分布在甘肅、陜西、河南、山西、青海、寧夏、四川、云南、西藏等地。禿瘡花藥性據(jù)《全國中草藥匯編》記載：“苦、澀、涼，有毒”；《陜西中草藥》載：“味苦、澀，性涼”；《民間獸醫(yī)本草》載：“味苦，性寒，有小毒”。 禿瘡花全草有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲等功效；對扁桃體炎、牙痛、咽喉痛、淋巴結(jié)核等有良好的療效；外用于禿瘡、疥癬、癰疽、瘺管、頑固性口炎、化膿性中耳炎、胃潰瘍、外傷、帶狀皰疹、陰囊癬、陰戶腫痛、霉菌性陰道炎瘡等疾病。從上世紀80年代開始，我國許多研究者對禿瘡花的成分和禿瘡花制劑的藥理作用進行了研究，暢行若等從禿瘡花中提取出禿瘡花堿、異紫堇堿、紫堇堿、原阿片堿、別隱品堿、青風藤堿等多種化合物。盧賢昭等研究表明，禿瘡花制劑能調(diào)節(jié)動物免疫系統(tǒng)機能、對結(jié)核病和腫瘤等有良好的治愈作用、對多種細菌、病毒、真菌性疾病和外科創(chuàng)傷等有治療作用。為了將禿瘡藥應用于臨床實踐中，本課題組在分析禿瘡花全草生物堿成分的同時，進行了禿瘡花制劑的研制和應用。在此基礎(chǔ)上，進一步研究禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞分泌IL-4和IFN-γ的影響，為制劑的應用積累試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 Balb/c小鼠 購于第四軍醫(yī)大學試驗動物中心。

1.1.2 制劑 禿瘡花針劑由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所制備。

1.1.3 儀器與材料 酶標儀(型號Model 680)、CO2培養(yǎng)箱(Asheville公司)、離心機等為西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學學院預防獸醫(yī)學試驗平臺儀器； 96孔細胞培養(yǎng)板、細胞計數(shù)板、0.1μL-1μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL、1mL-10mL加樣槍及EP管等購于欣博盛生物科技有限公司。

1.1.4 試劑與藥品 小鼠IL-4 ELISA試劑盒和小鼠IFN-γELISA試劑盒等為欣博盛生物科技有限公司；PBMI-1640培養(yǎng)液、HEPES、L-谷氨酰胺、ConA、犢牛血清、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖、臺盼藍、青鏈霉素、兩性霉素、多聚甲醛等購于欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 禿瘡花針劑對小鼠的腹腔注射

1.2.1.1禿瘡花針劑配制 取甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所制備的禿瘡花針劑，按其所含干物質(zhì)量用生理鹽水配制成4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL各100 mL, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 禿瘡花針劑對小鼠的腹腔注射 取28日齡Balb/c小鼠28只，觀察2d，隨機分成4組。3組每天分別腹腔注射4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL的禿瘡花內(nèi)用制劑，0.2 mL/每只;另1對照組每天分別腹腔注射生理鹽水，0.2 mL/每只。各組連續(xù)注射7 d。

1.2.2 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞分泌IL-4和IFN-γ的影響

1.2.2.1 小鼠淋巴細胞的體外培養(yǎng)及培養(yǎng)上清液分離 將1.2.1.2處理的3個試驗組和對照組中各5只小鼠，斷頸處死，75%乙醇消毒，無菌條件下取小鼠脾臟，過200目篩網(wǎng)，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。分離的淋巴細胞分別用Hanks液(pH7.4)洗3遍，計數(shù)，將其用完全PBMI-1640營養(yǎng)液分別配成1×106個細胞/mL。分別取各組1×106個細胞/mL 500μL 淋巴細胞懸液，各分置于96孔細胞培養(yǎng)板組成5×4×4個培養(yǎng)孔，每孔100μL。每孔分別加入10μg/mL的ConA 100μL，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h。各孔培養(yǎng)物分別離心取上清，4℃保存待測。

1.2.3.2 小鼠淋巴細胞培養(yǎng)上清液IL-4及IFN-γ的測定 按小鼠IL-4 ELISA試劑盒和小鼠IFN-γELISA試劑盒操作步驟進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞分泌IL-4和IFN-γ的影響結(jié)果 禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞分泌IL-4的影響結(jié)果見表1。從表1可以看出，3個試驗組小鼠淋巴細胞分泌的IL-4與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，其中4 mg/ml注射組小鼠淋巴細胞分泌的IL-4最高，約是對照組分泌量的4倍。

表1 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞分泌IL-4的影響結(jié)果

注 ：末標記表示對照組與試驗組之間差異不顯著(P>0.05)；﹟﹟表示與對照組之間差異極顯著(P<0.01)。

2.1.2 禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞分泌IFN-γ的影響結(jié)果 禿瘡花針劑對小鼠淋巴細胞分泌IFN-γ的影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，3個試驗組小鼠淋巴細胞分泌的IL-4與對照組相比差異極顯著或顯著(P<0.01或P<0.05)，其中4 mg/ml注射組小鼠淋巴細胞分泌的IFN-γ最高，約是對照組分泌量的37倍。

表2 禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞分泌IFN-γ的影響結(jié)果

注 ：﹟表示與對照組之間差異顯著(P<0.05)；﹟﹟表示與對照組之間差異極顯著(P<0.01)。

2.2 討論

從禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞分泌IL-4和IFN-γ的影響結(jié)果看，小鼠腹腔注射禿瘡花內(nèi)用針劑7 d后，分離小鼠淋巴細胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培養(yǎng)48 h后，小鼠淋巴細胞分泌IL-4和IFN-γ含量均明顯增多。其中4-20 mg/ mL注射組分泌IL-4和IFN-γ含量比較高；而100 mg/ mL注射組IL-4含量和IFN-γ含量增量低一些，但與對照組相比還是差異顯著。從分泌IL-4和IFN-γ增量上看，試驗組小鼠淋巴細胞分泌的IL-4最高約是對照組分泌量的4倍，試驗組小鼠淋巴細胞分泌的IFN-γ最高約是對照組分泌量的37倍，試驗結(jié)果提示,禿瘡花針劑能提高小鼠的細胞免疫和體液免疫水平;小鼠的細胞免疫水平遠高于體液免疫水平，禿瘡花針劑對細胞免疫調(diào)節(jié)的作用更大。試驗結(jié)果還提示,禿瘡花內(nèi)用針劑處理7天后，小鼠淋巴細胞功能正常，禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠免疫系統(tǒng)沒有不良影響。試驗結(jié)果表明，禿瘡花內(nèi)用針劑對小鼠淋巴細胞有明顯的調(diào)節(jié)功能，能提高小鼠的細胞免疫和體液免疫水平。