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    黃芪甲苷抑制p-130Cas表達(dá)緩解糖尿病腎病的作用機(jī)制研究

    2018-08-05 12:08:50何東元陳建國陳宜方鄭志貴
    浙江醫(yī)學(xué) 2018年14期
    關(guān)鍵詞:劑量融合糖尿病

    何東元 陳建國 陳宜方 鄭志貴

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是終末期腎?。╡nd stage kidney disease,ESKD)的首要病因,其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚[1]。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分,足細(xì)胞足突融合是DN患者蛋白尿的重要原因。p-130Cas作為接頭蛋白,參與足細(xì)胞及其他多種細(xì)胞信號通路的傳導(dǎo)與多種生命活動(dòng),包括細(xì)胞遷移、存活和增殖[2-3]。p-130Cas連接細(xì)胞骨架、腎小球基底膜和裂孔膜,對維持足細(xì)胞形態(tài)和功能有重要作用[4]。高糖誘導(dǎo)下,p-130Cas表達(dá)異??赡苁亲慵?xì)胞足突融合的重要環(huán)節(jié)。黃芪甲苷(AS-IV)是中藥黃芪的主要活性成分,既往研究報(bào)道AS-IV可緩解DN大鼠腎小球足細(xì)胞足突融合,減輕蛋白尿[5-6],但作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討AS-IV是否可能通過調(diào)節(jié)p-130Cas的表達(dá)來抑制足細(xì)胞足突融合,起到緩解DN的作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料和方法

    1.1 材料和儀器 鏈脲霉素(STZ)、AS-IV單體(TLC純度98%)、羧甲基纖維素(美國Sigma公司),Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript RT kit Total、Alexa 594(紅色)和Alexa 488(綠色)標(biāo)記的二抗(美國Invitrogen公司),抗p-130Cas、抗Synaptopodin、抗GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、ECL化學(xué)發(fā)光劑(美國Santa Cruz公司),RAPA蛋白裂解緩沖液、BCA蛋白檢測試劑盒(中國上海聯(lián)碩生物科技有限公司);熒光顯微鏡(日本尼康公司),Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),Rotor-Gene3000 PCR儀(澳大利亞Corbett Research公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 體外實(shí)驗(yàn)

    1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 足細(xì)胞(浙江醫(yī)院生物實(shí)驗(yàn)室提供)培養(yǎng)在含10U/ml干擾素、10%FBS、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素 RPMI 1640培養(yǎng)液中,在33℃環(huán)境下培養(yǎng)傳代,在37℃、無干擾素條件下培養(yǎng)14d誘導(dǎo)分化。分化的足細(xì)胞用含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,后分為以下4組:正常對照組(NC組):D-葡萄糖 5mmol/L;高糖組(HG 組):D-葡萄糖 30mmol/L;高糖+低劑量AS-IV組(HG+LD組):D-葡萄糖30mmol/L,AS-IV 50mg/L;高糖+高劑量AS-IV組(HG+HD組):D-葡萄糖 30mmol/L,AS-IV 100mg/L。

    1.2.1.2 Real time-PCR檢測p-130Cas mRNA的表達(dá) Trizol提取各組足細(xì)胞干預(yù)24、48h后的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript RT kit Total合成cDNA。p-130Cas上游序列為5′-CTACCCTCACCTCCAAAGTTC-3′,下游序列為 5′-CAGTTCCTTCTGGGTCTTCTC-3′。GAPDH為內(nèi)參,上游序列為 5′-TCCCTCAACATTGTCAGCAA-3′, 下 游 序 列 為 5′-AGCTCCACAACGGATACATT-3′。Rotor-Gene3000 PCR 儀進(jìn)行Realtime-PCR檢測。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5min,95℃變性 10s,59℃退火15s,72℃延伸 20s,擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。熒光定量分析軟件讀取并計(jì)算目標(biāo)mRNA/GAPDH mRNA的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值代表p-130Cas mRNA的表達(dá)水平。

    1.2.1.3 Western blot檢測p-130Cas蛋白的表達(dá) SDSPAGE凝膠電泳分離各組足細(xì)胞干預(yù)24、48h后的蛋白,電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。含2%牛血清白蛋白的TBST(20mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,0.1%Tween-20)室溫1h封閉非特異位點(diǎn),抗p-130Cas和抗GAPDH抗體4℃孵育24h,TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫下放置1h,ECL液顯色,X線片上曝光顯影、定影、沖洗、晾干。Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶光密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值代表p-130Cas蛋白的表達(dá)水平。

    1.2.2 動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

    1.2.2.1 動(dòng)物分組 180~220g的健康雄性SD大鼠購買自浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠隨機(jī)分為4組:正常對照組(Con組),糖尿病組(DN組),糖尿病+低劑量AS-IV(5mg/kg/d)組(DN+LD)組,糖尿病+高劑量 AS-IV(10mg/kg/d)組(DN+HD組)。每組10只大鼠。鏈脲霉素65mg/kg單次腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型。鏈脲霉素注射72h后空腹血糖>16.67mmol/L的大鼠認(rèn)為造模成功。高糖+低劑量AS-IV組、高糖+高劑量AS-IV組AS-IV干預(yù)在糖尿病造模成功后開始,持續(xù)8周。ASIV用1%羧甲基纖維素配置,灌胃給藥。Con組與DN組每日予同等劑量的羧甲基纖維素溶液,持續(xù)8周。在干預(yù)第4周末和第8周末檢測各組大鼠24h尿白蛋白。第8周末處死大鼠,留取腎臟組織以作后續(xù)檢測。

    1.2.2.2 病理學(xué)檢測腎臟組織形態(tài)改變 (1)4%多聚甲醛固定各組大鼠腎皮質(zhì)組織,常規(guī)石蠟切片,PASM和Masson染色,光鏡下觀察腎組織形態(tài)改變。(2)2%戊二醛固定各組大鼠腎皮質(zhì)組織,透射電鏡制樣、切片,電鏡下觀察足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

    1.2.2.3 免疫熒光檢測p-130Cas蛋白的表達(dá) 4%多聚甲醛固定各組大鼠腎組織冷凍切片15min,0.5%Triton X-100室溫穿透20min,PBS浸洗3次,正常山羊血清室溫封閉30min,滴加一抗4℃濕盒內(nèi)孵育24h,滴加稀釋好的熒光二抗,37℃濕盒內(nèi)孵育1h,DAPI避光孵育5min染核,封片液封片,熒光顯微鏡采集圖像觀察p-130Cas蛋白的表達(dá)情況。

    1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較(1)4組足細(xì)胞p-130Cas mRNA與蛋白表達(dá)水平;(2)4組大鼠24h尿白蛋白水平,腎臟病理學(xué)改變情況,腎臟足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)水平。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Stat 12.0統(tǒng)計(jì)軟件;計(jì)量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 4組足細(xì)胞p-130Cas mRNA表達(dá)水平比較 見圖1。

    圖1 4組足細(xì)胞p-130Cas mRNA表達(dá)水平比較

    由圖1可見,干預(yù)后24、48h,4組足細(xì)胞p-130Cas mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),HG 組高于 NC組(均 P<0.05),HG+LD、HG+HD 組均低于HG組(均P<0.05)。即高糖環(huán)境下足細(xì)胞p-130Cas mRNA表達(dá)明顯上調(diào),AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的p-130Cas mRNA表達(dá)上調(diào)。

    2.2 4組足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)水平比較 見圖2。

    圖3 4組大鼠腎臟病理學(xué)改變光鏡下所見(×200)

    由圖2可見,干預(yù)后24、48h,4組足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),HG 組高于NC組(均 P<0.05),HG+LD、HG+HD 組均低于HG組(均P<0.05)。即高糖環(huán)境下足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)明顯上調(diào),AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的p-130Cas蛋白表達(dá)上調(diào)。

    2.3 4組大鼠24h尿白蛋白水平比較 見表1。

    由表1可見,干預(yù)第4、8周末,4組大鼠24h尿白蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),DN組高于Con組(均P<0.05),DN+LD、DN+HD 組均低于DN組(均P<0.05)。即糖尿病大鼠24h尿白蛋白水平明顯上升,AS-IV劑量依賴性降低糖尿病大鼠24h尿白蛋白水平。

    表1 4組大鼠24h尿白蛋白水平比較(mg)

    2.4 4組大鼠腎臟病理學(xué)改變 見圖3(插頁)、4。

    由圖3可見,糖尿病大鼠腎小球增大,系膜增生,AS-IV劑量依賴性緩解糖尿病大鼠腎小球病變。由圖4可見,糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞足突顯著融合,AS-IV劑量依賴性抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞足突融合。

    2.5 4組大鼠腎臟足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)水平比較見圖5(插頁)。

    圖4 4組大鼠腎臟病理學(xué)改變電鏡下所見(×4200)

    圖5 4組大鼠腎臟足細(xì)胞p-130Cas蛋白免疫熒光檢測結(jié)果(×400)

    由圖5可見,糖尿病大鼠足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)明顯上調(diào),AS-IV可抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞p-130Cas蛋白上調(diào)。

    3 討論

    從糖尿病的首次被記載到發(fā)現(xiàn)糖尿病與腎臟疾病的關(guān)系,人類花了超過300年時(shí)間;但僅僅幾十年時(shí)間,DN就成了ESKD的首要病因[7]。DN的自然病程包括腎小球高濾過、進(jìn)展性蛋白尿、腎小球?yàn)V過率下降,最終導(dǎo)致ESKD[8]。DN最早期的病理學(xué)改變是腎小球基底膜增厚,其他變化包括內(nèi)皮細(xì)胞窗孔喪失、系膜增生、足細(xì)胞足突融合和足細(xì)胞丟失[8-9]。本研究成功建立糖尿病大鼠模型,糖尿病大鼠在第4周末出現(xiàn)白蛋白尿,第8周末白蛋白尿進(jìn)一步加重。光鏡下病理學(xué)顯示糖尿病大鼠出現(xiàn)腎小球增大和系膜增生。AS-IV劑量依賴性降低糖尿病大鼠白蛋白尿,緩解糖尿病腎臟病理學(xué)改變。

    足細(xì)胞在DN中扮演重要角色[10]。足細(xì)胞由功能和形態(tài)不同的3部分組成:細(xì)胞體、主要突觸和足突。足突間25~60nm的間隔由裂孔膜覆蓋。疾病狀態(tài)下足突的細(xì)胞骨架發(fā)生重排,由平行束狀變成致密的網(wǎng)狀,足突融合,腎小球通透性增加,臨床表現(xiàn)為蛋白尿。足突的細(xì)胞骨架由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成[11]。足突融合不是被動(dòng)現(xiàn)象,而是消耗能量的主動(dòng)過程。足突融合的機(jī)制十分復(fù)雜,尚未完全闡明。目前認(rèn)為引起足突融合的可能機(jī)制為:(1)病變直接干擾了足細(xì)胞的細(xì)胞骨架及其與α-actinin-4的聯(lián)系;(2)病變干擾了足突與基底膜之間的相互作用;(3)足細(xì)胞頂區(qū)受損,負(fù)電荷屏障破壞;(4)裂孔隔膜復(fù)合體及其相關(guān)的脂閥損傷[2]。足細(xì)胞足突融合是DN蛋白尿的關(guān)鍵。本研究電鏡下顯示糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯足細(xì)胞足突融合,AS-IV劑量依賴性緩解糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞足突融合。

    p-130Cas屬于Crk相關(guān)底物家族(Crk-associated substrate,Cas)成員。Cas作為接頭蛋白幾乎無處不在,在細(xì)胞黏附、遷移、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架間的信號傳導(dǎo)中均有重要作用[2]。Cas蛋白的過度表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞骨架改變,促進(jìn)細(xì)胞偽足的形成[12]。研究顯示,p-130Cas表現(xiàn)上調(diào)與乳腺癌、卵巢癌和肝癌進(jìn)展相關(guān)[12]。足細(xì)胞中p-130Cas彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中,在足細(xì)胞足突肌動(dòng)蛋白纖維末端聚集。p-130Cas一方面通過CD2AP等接頭蛋白與裂孔膜相連,另一方面通過局部黏附激酶及整合素與腎小球基底膜相連。高糖誘導(dǎo)的p-130Cas表達(dá)異常可能是DN足細(xì)胞足突融合的重要環(huán)節(jié)。膜性腎病患者足細(xì)胞p-130Cas上調(diào),而微小病變腎病患者足細(xì)胞p-130Cas下調(diào)[13]。雖然均出現(xiàn)足細(xì)胞足突融合,微小病變和膜性腎病發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)截然不同。因此足細(xì)胞p-130Cas表達(dá)變化和疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)。synaptopodin是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,只表達(dá)于腎小球的足細(xì)胞和后腦的突觸內(nèi)[14]。本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測synaptopodin,定位足細(xì)胞,結(jié)果顯示,糖尿病大鼠足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)明顯上調(diào),AS-IV劑量依賴性抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞p-130Cas蛋白表達(dá)上調(diào)。體外研究和體內(nèi)研究結(jié)果一致。高糖環(huán)境下足細(xì)胞p-130Cas蛋白與mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞p-130Cas蛋白與mRNA上調(diào)。

    綜上所述,AS-IV可能通過抑制p-130Cas表達(dá)上調(diào)抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞足突融合,緩解DN。本研究結(jié)果或?yàn)镈N的早期治療提供理論參考。

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