黃芪甲苷抑制p-130Cas表達緩解糖尿病腎病的作用機制研究

何東元 陳建國 陳宜方 鄭志貴

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是終末期腎病（end stage kidney disease,ESKD）的首要病因，其發(fā)病機制目前尚未完全清楚[1]。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，足細胞足突融合是DN患者蛋白尿的重要原因。p-130Cas作為接頭蛋白，參與足細胞及其他多種細胞信號通路的傳導與多種生命活動，包括細胞遷移、存活和增殖[2-3]。p-130Cas連接細胞骨架、腎小球基底膜和裂孔膜，對維持足細胞形態(tài)和功能有重要作用[4]。高糖誘導下，p-130Cas表達異?？赡苁亲慵毎阃蝗诤系闹匾h(huán)節(jié)。黃芪甲苷（AS-IV）是中藥黃芪的主要活性成分，既往研究報道AS-IV可緩解DN大鼠腎小球足細胞足突融合，減輕蛋白尿[5-6]，但作用機制尚未完全闡明。本研究旨在探討AS-IV是否可能通過調節(jié)p-130Cas的表達來抑制足細胞足突融合，起到緩解DN的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 鏈脲霉素（STZ）、AS-IV單體（TLC純度98%）、羧甲基纖維素（美國Sigma公司），Trizol、逆轉錄試劑盒SuperScript RT kit Total、Alexa 594（紅色）和Alexa 488（綠色）標記的二抗（美國Invitrogen公司），抗p-130Cas、抗Synaptopodin、抗GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗、ECL化學發(fā)光劑（美國Santa Cruz公司），RAPA蛋白裂解緩沖液、BCA蛋白檢測試劑盒（中國上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；熒光顯微鏡（日本尼康公司），Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），Rotor-Gene3000 PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司）。

1.2 方法

1.2.1 體外實驗

1.2.1.1 細胞培養(yǎng)和分組 足細胞（浙江醫(yī)院生物實驗室提供）培養(yǎng)在含10U/ml干擾素、10%FBS、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素 RPMI 1640培養(yǎng)液中，在33℃環(huán)境下培養(yǎng)傳代，在37℃、無干擾素條件下培養(yǎng)14d誘導分化。分化的足細胞用含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，后分為以下4組：正常對照組（NC組）：D-葡萄糖 5mmol/L；高糖組（HG 組）：D-葡萄糖 30mmol/L；高糖+低劑量AS-IV組（HG+LD組）：D-葡萄糖30mmol/L，AS-IV 50mg/L；高糖+高劑量AS-IV組（HG+HD組）：D-葡萄糖 30mmol/L，AS-IV 100mg/L。

1.2.1.2 Real time-PCR檢測p-130Cas mRNA的表達 Trizol提取各組足細胞干預24、48h后的總RNA。逆轉錄試劑盒SuperScript RT kit Total合成cDNA。p-130Cas上游序列為5′-CTACCCTCACCTCCAAAGTTC-3′，下游序列為 5′-CAGTTCCTTCTGGGTCTTCTC-3′。GAPDH為內參，上游序列為 5′-TCCCTCAACATTGTCAGCAA-3′， 下 游 序 列 為 5′-AGCTCCACAACGGATACATT-3′。Rotor-Gene3000 PCR 儀進行Realtime-PCR檢測。反應條件為 94℃預變性 5min，95℃變性 10s，59℃退火15s，72℃延伸 20s，擴增 40 個循環(huán)，最后72℃延伸5min。熒光定量分析軟件讀取并計算目標mRNA/GAPDH mRNA的比值。實驗重復3次，取均值代表p-130Cas mRNA的表達水平。

1.2.1.3 Western blot檢測p-130Cas蛋白的表達 SDSPAGE凝膠電泳分離各組足細胞干預24、48h后的蛋白，電轉膜至PVDF膜。含2%牛血清白蛋白的TBST（20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1%Tween-20）室溫1h封閉非特異位點，抗p-130Cas和抗GAPDH抗體4℃孵育24h，TBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下放置1h，ECL液顯色，X線片上曝光顯影、定影、沖洗、晾干。Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶光密度。實驗重復3次，取平均值代表p-130Cas蛋白的表達水平。

1.2.2 動物體內實驗

1.2.2.1 動物分組 180～220g的健康雄性SD大鼠購買自浙江大學動物實驗中心。大鼠隨機分為4組：正常對照組（Con組），糖尿病組（DN組），糖尿病+低劑量AS-IV（5mg/kg/d）組（DN+LD）組，糖尿病+高劑量 AS-IV（10mg/kg/d）組（DN+HD組）。每組10只大鼠。鏈脲霉素65mg/kg單次腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型。鏈脲霉素注射72h后空腹血糖＞16.67mmol/L的大鼠認為造模成功。高糖+低劑量AS-IV組、高糖+高劑量AS-IV組AS-IV干預在糖尿病造模成功后開始，持續(xù)8周。ASIV用1%羧甲基纖維素配置，灌胃給藥。Con組與DN組每日予同等劑量的羧甲基纖維素溶液，持續(xù)8周。在干預第4周末和第8周末檢測各組大鼠24h尿白蛋白。第8周末處死大鼠，留取腎臟組織以作后續(xù)檢測。

1.2.2.2 病理學檢測腎臟組織形態(tài)改變 （1）4%多聚甲醛固定各組大鼠腎皮質組織，常規(guī)石蠟切片，PASM和Masson染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)改變。（2）2%戊二醛固定各組大鼠腎皮質組織，透射電鏡制樣、切片，電鏡下觀察足細胞形態(tài)結構變化。

1.2.2.3 免疫熒光檢測p-130Cas蛋白的表達 4%多聚甲醛固定各組大鼠腎組織冷凍切片15min，0.5%Triton X-100室溫穿透20min，PBS浸洗3次，正常山羊血清室溫封閉30min，滴加一抗4℃濕盒內孵育24h，滴加稀釋好的熒光二抗，37℃濕盒內孵育1h，DAPI避光孵育5min染核，封片液封片，熒光顯微鏡采集圖像觀察p-130Cas蛋白的表達情況。

1.3 觀察指標 觀察并比較（1）4組足細胞p-130Cas mRNA與蛋白表達水平；（2）4組大鼠24h尿白蛋白水平，腎臟病理學改變情況，腎臟足細胞p-130Cas蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用Stat 12.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組足細胞p-130Cas mRNA表達水平比較 見圖1。

圖1 4組足細胞p-130Cas mRNA表達水平比較

由圖1可見，干預后24、48h，4組足細胞p-130Cas mRNA表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），HG 組高于 NC組（均 P＜0.05），HG+LD、HG+HD 組均低于HG組（均P＜0.05）。即高糖環(huán)境下足細胞p-130Cas mRNA表達明顯上調，AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導的p-130Cas mRNA表達上調。

2.2 4組足細胞p-130Cas蛋白表達水平比較 見圖2。

圖3 4組大鼠腎臟病理學改變光鏡下所見（×200）

由圖2可見，干預后24、48h，4組足細胞p-130Cas蛋白表達水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），HG 組高于NC組（均 P＜0.05），HG+LD、HG+HD 組均低于HG組（均P＜0.05）。即高糖環(huán)境下足細胞p-130Cas蛋白表達明顯上調，AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導的p-130Cas蛋白表達上調。

2.3 4組大鼠24h尿白蛋白水平比較 見表1。

由表1可見，干預第4、8周末，4組大鼠24h尿白蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），DN組高于Con組（均P＜0.05），DN+LD、DN+HD 組均低于DN組（均P＜0.05）。即糖尿病大鼠24h尿白蛋白水平明顯上升，AS-IV劑量依賴性降低糖尿病大鼠24h尿白蛋白水平。

表1 4組大鼠24h尿白蛋白水平比較（mg）

2.4 4組大鼠腎臟病理學改變 見圖3（插頁）、4。

由圖3可見，糖尿病大鼠腎小球增大，系膜增生，AS-IV劑量依賴性緩解糖尿病大鼠腎小球病變。由圖4可見，糖尿病大鼠腎臟足細胞足突顯著融合，AS-IV劑量依賴性抑制糖尿病大鼠足細胞足突融合。

2.5 4組大鼠腎臟足細胞p-130Cas蛋白表達水平比較見圖5（插頁）。

圖4 4組大鼠腎臟病理學改變電鏡下所見（×4200）

圖5 4組大鼠腎臟足細胞p-130Cas蛋白免疫熒光檢測結果（×400）

由圖5可見，糖尿病大鼠足細胞p-130Cas蛋白表達明顯上調，AS-IV可抑制糖尿病大鼠足細胞p-130Cas蛋白上調。

3 討論

從糖尿病的首次被記載到發(fā)現(xiàn)糖尿病與腎臟疾病的關系，人類花了超過300年時間；但僅僅幾十年時間，DN就成了ESKD的首要病因[7]。DN的自然病程包括腎小球高濾過、進展性蛋白尿、腎小球濾過率下降，最終導致ESKD[8]。DN最早期的病理學改變是腎小球基底膜增厚，其他變化包括內皮細胞窗孔喪失、系膜增生、足細胞足突融合和足細胞丟失[8-9]。本研究成功建立糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠在第4周末出現(xiàn)白蛋白尿，第8周末白蛋白尿進一步加重。光鏡下病理學顯示糖尿病大鼠出現(xiàn)腎小球增大和系膜增生。AS-IV劑量依賴性降低糖尿病大鼠白蛋白尿，緩解糖尿病腎臟病理學改變。

足細胞在DN中扮演重要角色[10]。足細胞由功能和形態(tài)不同的3部分組成：細胞體、主要突觸和足突。足突間25～60nm的間隔由裂孔膜覆蓋。疾病狀態(tài)下足突的細胞骨架發(fā)生重排，由平行束狀變成致密的網(wǎng)狀，足突融合，腎小球通透性增加，臨床表現(xiàn)為蛋白尿。足突的細胞骨架由肌動蛋白構成[11]。足突融合不是被動現(xiàn)象，而是消耗能量的主動過程。足突融合的機制十分復雜，尚未完全闡明。目前認為引起足突融合的可能機制為：（1）病變直接干擾了足細胞的細胞骨架及其與α-actinin-4的聯(lián)系；（2）病變干擾了足突與基底膜之間的相互作用；（3）足細胞頂區(qū)受損，負電荷屏障破壞；（4）裂孔隔膜復合體及其相關的脂閥損傷[2]。足細胞足突融合是DN蛋白尿的關鍵。本研究電鏡下顯示糖尿病大鼠出現(xiàn)明顯足細胞足突融合，AS-IV劑量依賴性緩解糖尿病大鼠腎臟足細胞足突融合。

p-130Cas屬于Crk相關底物家族（Crk-associated substrate，Cas）成員。Cas作為接頭蛋白幾乎無處不在，在細胞黏附、遷移、細胞外結構和細胞骨架間的信號傳導中均有重要作用[2]。Cas蛋白的過度表達可誘導細胞骨架改變，促進細胞偽足的形成[12]。研究顯示，p-130Cas表現(xiàn)上調與乳腺癌、卵巢癌和肝癌進展相關[12]。足細胞中p-130Cas彌散分布于細胞質中，在足細胞足突肌動蛋白纖維末端聚集。p-130Cas一方面通過CD2AP等接頭蛋白與裂孔膜相連，另一方面通過局部黏附激酶及整合素與腎小球基底膜相連。高糖誘導的p-130Cas表達異?？赡苁荄N足細胞足突融合的重要環(huán)節(jié)。膜性腎病患者足細胞p-130Cas上調，而微小病變腎病患者足細胞p-130Cas下調[13]。雖然均出現(xiàn)足細胞足突融合，微小病變和膜性腎病發(fā)病機制和臨床表現(xiàn)截然不同。因此足細胞p-130Cas表達變化和疾病發(fā)病機制相關。synaptopodin是一種肌動蛋白結合蛋白，只表達于腎小球的足細胞和后腦的突觸內[14]。本研究應用免疫熒光技術檢測synaptopodin，定位足細胞，結果顯示，糖尿病大鼠足細胞p-130Cas蛋白表達明顯上調，AS-IV劑量依賴性抑制糖尿病大鼠足細胞p-130Cas蛋白表達上調。體外研究和體內研究結果一致。高糖環(huán)境下足細胞p-130Cas蛋白與mRNA表達明顯上調。AS-IV劑量依賴性抑制高糖誘導的足細胞p-130Cas蛋白與mRNA上調。

綜上所述，AS-IV可能通過抑制p-130Cas表達上調抑制高糖誘導的足細胞足突融合，緩解DN。本研究結果或為DN的早期治療提供理論參考。