基于微滴數(shù)字PCR阿膠定量檢測(cè)方法的建立

王一村,蘇本玉，李 娜,許士明,高靜靜,周莉莉

(山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院/國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,山東濟(jì)南 250102)

阿膠也稱驢皮膠,與人參、鹿茸一起被稱為“中藥三寶”[1]。其補(bǔ)血、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、抗輻射、抑制腫瘤、保護(hù)大腦、促進(jìn)骨愈合生長(zhǎng)以及保護(hù)心血管等功效都已被證實(shí)[2-4]。阿膠產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展,現(xiàn)已融入健康中國(guó)發(fā)展戰(zhàn)略。然而,在巨大經(jīng)濟(jì)利益的誘惑下,阿膠行業(yè)內(nèi)制假售假現(xiàn)象嚴(yán)重[5-6]。假阿膠及其制品雖在外觀、氣味、質(zhì)地、口感等方面與真品無(wú)明顯差異,但阿膠純度低。有些摻假阿膠甚至威脅人體健康,嚴(yán)重?cái)_亂了阿膠市場(chǎng)秩序。當(dāng)前,阿膠的真假鑒別和純度鑒定是該行業(yè)急需解決的瓶頸難題。

大量學(xué)者已建立并應(yīng)用各類方法去辨別阿膠的真?zhèn)?比如高效液相色譜及質(zhì)譜法[7-8]、光譜法[9-10]、酶聯(lián)免疫法[11]、電泳法[12-13]以及分子生物學(xué)方法[14-15]等,但仍然無(wú)法對(duì)阿膠純度和品質(zhì)進(jìn)行評(píng)估和評(píng)價(jià)。要從根本上解決此類問(wèn)題,對(duì)阿膠進(jìn)行定量分析才是關(guān)鍵。由于技術(shù)上的難點(diǎn),目前行業(yè)內(nèi)阿膠定量分析研究極少,幾乎處于研究空白。令人欣喜的是,微滴數(shù)字PCR的出現(xiàn)有望解決阿膠定量這一難題。

微滴數(shù)字PCR(ddPCR)是一種對(duì)核酸進(jìn)行精確定量的全新方法[16-17],它利用有限稀釋及波松分布分析對(duì)目的DNA的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量[18]。因此對(duì)于源性成分分析來(lái)說(shuō),ddPCR不僅能進(jìn)行定性分析,更重要的是能進(jìn)行精確定量。該方法不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線和對(duì)照、不受PCR抑制物及PCR效率的影響,通過(guò)單分子計(jì)數(shù)方式實(shí)現(xiàn)基因拷貝數(shù)的定量,是絕對(duì)意義上的定量[19]。目前,ddPCR技術(shù)在源性成分摻假的定量檢測(cè)上已初見(jiàn)鋒芒,而且在鑒定市售相關(guān)產(chǎn)品中取得了較大成績(jī)[20-23]。因此,將該技術(shù)引用到阿膠及其制品的定量檢測(cè)上是完全可行的。阿膠是以驢源性成分為唯一動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)品,本研究應(yīng)用ddPCR技術(shù),通過(guò)測(cè)定阿膠中驢源性成分的絕對(duì)含量達(dá)到對(duì)阿膠進(jìn)行定量分析的目的。該方法的建立有望對(duì)市場(chǎng)上阿膠產(chǎn)品進(jìn)行純度測(cè)定,從而突破現(xiàn)階段無(wú)法對(duì)阿膠及其相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行純度評(píng)價(jià)的難題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿膠純品標(biāo)準(zhǔn)樣、驢皮、馬皮、豬皮及牛皮 由山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)濟(jì)南阿膠制品有限公司提供;生鮮羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鵪鶉肉以及水稻、小麥、花生、杏、玉米、大豆 濟(jì)南市內(nèi)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);明膠粉(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠;貂皮和狐貍皮 由山東泰安市某養(yǎng)殖基地提供;8個(gè)品牌阿膠及2個(gè)阿膠速溶粉 普通消費(fèi)市場(chǎng);DNA提取試劑盒 德國(guó)凱杰(QIAGEN)公司;驢源性引物和探針 由寶生物工程(大連)有限公司(Takara)合成;ddPCR Master Mix 美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)公司。

Bio-Rad QX200 ddPCR微滴生成儀 美國(guó)Bio-Rad公司;梯度PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司;Nanodrop 1000生物紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司;EC3Darkroom凝膠成像儀 美國(guó)UVP公司;5424R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;DW-86L286超低溫冰箱 美國(guó)T.F.S公司;BSA224S-CW電子天平 德國(guó)Sartorius公司;RCT磁力攪拌器、LAB DANCER漩渦振蕩器、A11分析研磨機(jī) 德國(guó)IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿膠樣品制備 取新開(kāi)封阿膠或阿膠相關(guān)產(chǎn)品于分析研磨機(jī)中研磨,如樣品不易處理,可用液氮研磨。磨成粉后于烘箱中85 ℃烘24 h進(jìn)行樣品稱取。將阿膠純品作為標(biāo)準(zhǔn)品,其他8個(gè)阿膠、2個(gè)市售阿膠粉及明膠粉經(jīng)上述方法研磨烘干處理后作為待測(cè)品。樣品處理過(guò)程中不同樣品隔離處理,嚴(yán)防交叉污染。

1.2.2 DNA提取 各類產(chǎn)品及各類組織的DNA提取步驟嚴(yán)格按照QIAGEN試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用生物紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定DNA含量,保證目的DNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0范圍內(nèi),-20 ℃保存?zhèn)溆?于24 h內(nèi)完成下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 ddPCR檢測(cè)用引物探針 檢測(cè)阿膠中驢源性成分的引物探針序列參考國(guó)家出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[24]合成。F:5′-AATAGCTCTAGCCGTACGGC TAACT-3′,R:5′-CAGGATAATGAATGTAATAAGGG CTG-3′,探針:5′-FAM-TGCCGGACATCTTCTAATCC ACCTT-ECLIPSE-3′。

1.2.4 ddPCR檢測(cè)程序 ddPCR反應(yīng)采用20 μL體系:上下游引物各1.8 μL(900 nmol/L),探針0.8 μL(250 nmol/L),Bio-Rad ddPCR Master Mix 10 μL,模板4 μL,無(wú)菌水補(bǔ)齊至20 μL。利用微滴生成器將20 μL反應(yīng)液生成不低于15000個(gè)DNA模板和試劑隨機(jī)分布的微滴。PCR反應(yīng)程序如下:95 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s;60 ℃ 1 min;98 ℃ 10 min;40個(gè)循環(huán),4 ℃保存。最后用微滴分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析,分析軟件為QuantaSoft。

1.2.5 引物探針特異性分析 應(yīng)用兩種方法進(jìn)行引物探針的特異性驗(yàn)證,一是利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行引物探針序列的同源性比對(duì)分析。二是以試劑盒提取的驢源性DNA為陽(yáng)性對(duì)照,阿膠中有可能摻假的馬、豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、鵪鶉、貂、狐貍、水稻、小麥、花生、杏、玉米、大豆源性DNA為模板進(jìn)行特異性ddPCR檢測(cè)分析。

1.2.6 阿膠質(zhì)量與拷貝數(shù)換算公式的建立

1.2.6.1 阿膠質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系 分別稱取20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 mg共10個(gè)質(zhì)量梯度的標(biāo)準(zhǔn)品阿膠粉末進(jìn)行DNA基因組的提取,實(shí)驗(yàn)步驟和操作保持嚴(yán)格一致。利用生物紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定DNA含量,每個(gè)梯度樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6.2 阿膠DNA含量與拷貝數(shù)的關(guān)系 依據(jù)測(cè)定后的阿膠DNA濃度對(duì)樣品DNA進(jìn)行梯度稀釋,確定10個(gè)DNA濃度進(jìn)行下一步ddPCR的檢測(cè),從而確定各濃度梯度的目的DNA拷貝數(shù),每個(gè)梯度重復(fù)3次。10個(gè)濃度梯度依次為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ng/μL,每次模板選用4 μL進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。

1.2.7 ddPCR準(zhǔn)確性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證所建方法的準(zhǔn)確性,分別稱取10個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度的阿膠粉與不含驢源性的明膠粉的混合品進(jìn)行DNA提取?；旌掀房傎|(zhì)量為100 mg,10個(gè)梯度樣品中阿膠粉含量依次為10%～100%,每個(gè)梯度以10%遞增。對(duì)混合樣品進(jìn)行DNA提取,5倍稀釋后取4 μL進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。

1.2.8 市售樣品的檢測(cè) 將從市場(chǎng)上搜集到的不同品牌的阿膠及阿膠速溶粉經(jīng)1.2.1處理后進(jìn)行DNA提取,稀釋5倍后取4 μL進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。用所建立方法進(jìn)行阿膠定量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證所建立方法的實(shí)際應(yīng)用情況。所建方法測(cè)得阿膠含量的實(shí)際值與進(jìn)行DNA提取的市售阿膠總質(zhì)量的比值即為市售阿膠的純度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,利用Microsoft Office Excel進(jìn)行部分?jǐn)?shù)據(jù)處理和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針的特異性分析

1.2.5中引物探針的同源序列比對(duì)分析未發(fā)現(xiàn)同源性高的其他物種存在,而且ddPCR的特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)該引物探針在除驢源性陽(yáng)性DNA外的其他所檢物種DNA中出現(xiàn)交叉擴(kuò)增,這說(shuō)明所引用標(biāo)準(zhǔn)[24]中的引物探針特異性良好,符合本研究的要求。

2.2 阿膠質(zhì)量與DNA含量關(guān)系確定

利用1.2.6.1的方法確定阿膠質(zhì)量與DNA含量的關(guān)系。結(jié)果表明阿膠在20～200 mg質(zhì)量范圍內(nèi),阿膠質(zhì)量與相應(yīng)質(zhì)量提取到的DNA含量之間呈現(xiàn)線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0.9963(圖1),說(shuō)明相關(guān)性顯著。

圖1 阿膠質(zhì)量與相應(yīng)DNA含量的關(guān)系Fig.1 The linear relationship between quantity of Donkey-hide Gelatin(mg)and corresponding DNA content(ng)

2.3 DNA含量與基因拷貝數(shù)關(guān)系確定

利用1.2.6.2的方法確定阿膠DNA含量與目的基因拷貝數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示ddPCR在檢測(cè)過(guò)程中,每個(gè)樣品的微滴生成量均在15000以上,完全滿足定量檢測(cè)的需求。從圖2中可以看出,在選用的阿膠DNA濃度范圍(10～100 ng)內(nèi),即阿膠DNA質(zhì)量在40～400 ng質(zhì)量范圍內(nèi),DNA含量與目的基因拷貝數(shù)之間呈現(xiàn)線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0.9945(圖1),說(shuō)明相關(guān)性顯著。

圖2 阿膠DNA含量與目的基因拷貝數(shù)的關(guān)系Fig.2 The linear relationship between DNA content(ng) and the target DNA copy number

2.4 阿膠質(zhì)量與目的基因拷貝數(shù)關(guān)系確定

根據(jù)2.2中確立的阿膠質(zhì)量與DNA含量之間的關(guān)系,以及2.3中確立的阿膠DNA含量與目的基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系,以阿膠DNA含量為中間過(guò)渡換算值,確定出阿膠質(zhì)量與目的基因拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系為M阿膠=0.13C+3.05。其中,M阿膠為阿膠的質(zhì)量(mg),C為每微升的目的基因拷貝數(shù)(copies/μL)。

2.5 ddPCR準(zhǔn)確性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證所建立方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性,分別提取已知阿膠質(zhì)量的阿膠與明膠的10個(gè)梯度混合樣品提取DNA,稀釋5倍后進(jìn)行ddPCR的檢測(cè),按2.4中建立的阿膠質(zhì)量與目的基因拷貝數(shù)的關(guān)系確定混合樣品中的實(shí)測(cè)阿膠質(zhì)量與實(shí)際質(zhì)量進(jìn)行比對(duì),每個(gè)梯度重復(fù)3次。值得注意的是,DNA的提取過(guò)程受其他因素的影響較大,比如不同樣品間的差異、樣品處理的差異、DNA降解、操作差異甚至污染等等,如3次樣品DNA濃度檢測(cè)結(jié)果差異明顯,應(yīng)重新進(jìn)行DNA提取。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表1所示。從結(jié)果可以看出,實(shí)際測(cè)得的數(shù)值與真實(shí)值基本保持一致,最大實(shí)測(cè)偏差僅為4.0%,平行樣品穩(wěn)定性良好。這表明本研究所建立的利用ddPCR對(duì)阿膠進(jìn)行定量檢測(cè)的方法穩(wěn)定可靠。

表1 已知質(zhì)量的阿膠ddPCR定量驗(yàn)證Table 1 Quantitative verification of Donkey-hide Gelatin with given concentrations by ddPCR

2.6 市場(chǎng)內(nèi)不同阿膠及阿膠產(chǎn)品的檢測(cè)

使用本研究建立的ddPCR阿膠定量檢測(cè)方法,對(duì)市場(chǎng)內(nèi)銷售的不同品牌的8款阿膠及2款阿膠附屬產(chǎn)品阿膠速溶粉進(jìn)行定量檢測(cè),計(jì)算每個(gè)阿膠產(chǎn)品的純度。每個(gè)樣品經(jīng)DNA提取后,稀釋5倍檢測(cè),重復(fù)3次,結(jié)果如表2所示。從結(jié)果可以看出,在阿膠產(chǎn)品中,1、3和4號(hào)阿膠純度較高,純度均在90%以上,尤其是3號(hào)樣品,阿膠含量略高于本研究中的標(biāo)準(zhǔn)品。6、7、8號(hào)阿膠含量次之,2和5號(hào)產(chǎn)品阿膠含量相對(duì)較低,而2號(hào)僅為23.3%。對(duì)于阿膠產(chǎn)品阿膠速溶粉來(lái)說(shuō),阿膠含量分別為44.8%和39.8%。這說(shuō)明現(xiàn)市場(chǎng)上銷售的各類阿膠及其產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,純度有較大差異。以上結(jié)果再次說(shuō)明本研究開(kāi)發(fā)的ddPCR方法能夠進(jìn)行阿膠及其相關(guān)產(chǎn)品中阿膠含量的定量檢測(cè),可以用來(lái)進(jìn)行阿膠及相關(guān)產(chǎn)品的摻假和純度鑒定,有很高的實(shí)用性。

表2 市場(chǎng)內(nèi)阿膠與阿膠相關(guān)產(chǎn)品的定量分析Table 2 Quantitative analysis of Donkey-hide Gelatin and its subsidiary products

3 結(jié)論

阿膠的主要原材料是驢皮,本研究通過(guò)建立阿膠質(zhì)量與驢源性基因拷貝數(shù)的關(guān)系,利用ddPCR技術(shù)檢測(cè)阿膠的絕對(duì)含量。研究表明,在一定質(zhì)量范圍內(nèi),阿膠質(zhì)量與DNA含量呈線性關(guān)系。在一定DNA濃度范圍內(nèi),DNA含量與DNA絕對(duì)拷貝數(shù)間亦呈線性關(guān)系。利用三者間的兩兩線性關(guān)系,以DNA含量為中間換算值,得到阿膠質(zhì)量與DNA絕對(duì)拷貝數(shù)間公式為M阿膠=0.13C+3.05。利用此公式,通過(guò)檢測(cè)未知樣品中驢源性基因的DNA絕對(duì)拷貝數(shù)來(lái)得到樣品中阿膠的絕對(duì)含量。準(zhǔn)確性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿膠含量實(shí)測(cè)值與真實(shí)值基本保持一致,實(shí)測(cè)值偏差最大僅為4%,這說(shuō)明本研究建立的方法準(zhǔn)確可靠。為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的應(yīng)用能力,選用市場(chǎng)上銷售的8款阿膠及2款阿膠附屬產(chǎn)品阿膠速溶粉進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)8款阿膠中,3款阿膠純度較高,純度均在90%以上,2款純度較低,最低的純度僅為23.3%。這說(shuō)明市場(chǎng)上銷售的不同品牌阿膠間的阿膠純度差異大,質(zhì)量參差不齊。而2款阿膠速溶粉的阿膠純度均在40%左右,這與速溶粉中添加了其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或成分有關(guān)。

以上結(jié)果表明本研究建立的ddPCR方法檢測(cè)阿膠含量準(zhǔn)確、可靠。該技術(shù)可填補(bǔ)阿膠行業(yè)定量檢測(cè)空白,緩解市場(chǎng)中阿膠及相關(guān)產(chǎn)品造假嚴(yán)重的突出現(xiàn)狀,亦可為政府監(jiān)管提供依據(jù)及科技支撐,該研究具有廣闊的應(yīng)用前景,并可產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益,對(duì)阿膠行業(yè)發(fā)展將起到引領(lǐng)和重要的示范作用。