4種典型谷物中酚類化合物的抗氧化和抗癌細(xì)胞增殖活性

姚 惠,趙 彬,崔潔媚,段玉清,張海暉,張 迪,蔡梅紅

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

植物酚類化合物是高等植物的一種次級代謝產(chǎn)物,是植物化學(xué)物質(zhì)的主要組分之一[1],廣泛分布于蔬菜、水果、香辛料、谷物、豆類和果仁等各種高等植物器官中,主要分為植物黃酮類、植物酚酸類和植物單寧類這3大類[2]。近年研究表明,植物酚類化合物具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、抗輻射等多種生物活性[3-5],且具有一定的抗癌作用[6-8],并因同時具有天然、高效、毒性低等特點(diǎn)而備受消費(fèi)者青睞。全谷物食品被認(rèn)為是谷物在加工過程中僅僅去掉谷物最外面的谷殼,保留下完整的胚芽與糊粉層的谷物食品。近年來全谷物食品越來越受到人們的歡迎,食用全谷物食品有良好的保健作用。全谷物中含有酚類化合物、植酸、維生素等在內(nèi)的豐富生物活性成分,比其他谷物具有更高的營養(yǎng)價值。谷物種類是影響谷物中酚類化合物含量的主要因素之一,不同種類谷物中的酚類化合物含量相差較大[9-12]。

基于此,本文以4種常見的全谷物蕎麥、大麥、小麥、水稻為原料,通過初步分離和純化,明確其總酚(The total phenolic contents,TPC)和總黃酮含量(The total flavonoid contents,TFC),利用HPLC-MS初步鑒定了4種谷物中酚類化合物的組成。在此基礎(chǔ)上,初步研究4種谷物中酚類化合物的組成、抗氧化性和抗癌細(xì)胞增殖活性,并探討其酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性和抗癌細(xì)胞增殖活性之間的相關(guān)性,為谷物酚類物質(zhì)的進(jìn)一步研究提供一定理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥、大麥、小麥、水稻 鎮(zhèn)江市場(同年收獲);結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞 上海細(xì)胞庫;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶 美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽試劑(MTT)、DPPH試劑,二甲基亞砜(DMSO) 美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、非必需氨基酸(Nonessential Amino Acid,NEAA) Hyclone公司;甲醇(HPLC級) 美國TEDIA公司;沒食子酸(≥99.8%) 中國食品藥品鑒定研究院;其他常用試劑略。

BS224S型電子精密分析天平 Sartorious Germany公司;ALPHAI-4/2-4型冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST公司;DL-5C型離心機(jī) 上海安亭有限公司;HERAcell240i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;Tecan Infinite PROTWIN200型多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司;ThermoLXQ型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo公司;ZORBAX SB-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 μm) 美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酚類化合物的提取和純化 將4種谷物脫去谷殼,粉碎機(jī)粉碎,過60目篩,用石油醚對粉末脫脂,過濾,收集殘渣后置于-20 ℃冷藏。分別稱取各樣品粉末50 g,與70%(v/v)乙醇混合,料液比為1∶15 (g∶mL),于45 ℃條件下浸提,浸提液過濾,收集上清液,殘渣按照上述方法重復(fù)浸提2次[13]。合并2次浸提液,于45 ℃下減壓濃縮至無醇后,以5倍柱體積的浸提液進(jìn)行上樣(流速為2 mL/min),經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂分離/富集,以體積70%乙醇水洗脫(洗脫流速為2 mL/min),收集乙醇洗脫液,45 ℃下減壓濃縮,經(jīng)-70 ℃冷凍干燥得到酚類化合物粉末,于-20 ℃密封保存,備用。

1.2.2 TPC的測定 采用Folin-clocalteau[14-15]法,略有改動。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度稀釋為18.75、37.5、75、150、300 μg/mL。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液與4.0 mL Folin試劑(10倍稀釋)混合,再加入5.0 mL7.5%的Na2CO3溶液,25 ℃水浴2 h,于765 nm處測定其OD值(水和試劑的混合物作為空白),并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.00825x+0.02047(R2=0.9983)。樣品測定:不同種類谷物酚類提取物樣品按照上述方法測定其OD值,樣品TPC用沒食子酸當(dāng)量[GAE mg/100 g干重(dw)]表示。

1.2.4 4種谷物酚類物質(zhì)組成的HPLC-MS分析 采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用測定谷物中酚類物質(zhì)的組成,結(jié)合文獻(xiàn)[17-19]進(jìn)行測定,色譜條件為:液相色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 μm);流動相由含有1.0%(v/v)冰乙酸的超純水(A)和甲醇(B)組成。洗脫梯度:0～10 min,5%～30% B;10～25 min,30%-50% B;25～35 min,50%～70% B;35～40 min,70～95% B。流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL,檢測波長為280 nm。

質(zhì)譜條件為:ESI離子源負(fù)離子檢測模式,離子源正離子檢測模式1.8 kV,使用氮?dú)庾鳛楦稍锖挽F化氣體,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL,掃描波長為50～2000 m/z。

1.2.5 還原能力的測定 采用文獻(xiàn)[20-21],略有改動。將一定質(zhì)量的谷物提取物粉末溶解后配制成適當(dāng)濃度的樣品溶液。將1.0 mL樣品溶液與2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)及2.5 mL 10%的三氯乙酸,充分混合后在3000 r/min的條件下離心10 min,吸取2.5 mL的上清液,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,充分混合后于700 nm處測定其OD值。以抗壞血酸(VC)作為陽性對照。

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定 采用文獻(xiàn)[22-24],略有改動。取一定質(zhì)量不同種類谷物提取物粉末溶解后配制適當(dāng)濃度的樣品溶液。取2.0 mL 0.25 mmol的DPPH·溶液與2.0 mL的樣品溶液充分混勻,避光放置30 min,測定517 nm處OD值(以2.0 mL DPPH·溶液和2.0 mL蒸餾水的混合物作為空白對照)。以VC作為陽性對照。對DPPH·清除率計算公式如下:

式中:A0為2.0 mL DPPH·+2.0 mL無水乙醇的OD值;Ai為2.0 mL DPPH·+2.0 mL樣品溶液的OD值;Aj為2.0 mL無水乙醇+2.0 mL樣品溶液的OD值。

1.2.7 對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的影響 采用MTT分析法檢測4種谷物對Caco-2細(xì)胞增殖能力[25-26]。取對數(shù)期的Caco-2細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后,以2.0×104個細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中,孵育24 h后,經(jīng)100 μL不同濃度的樣品(0～100 μg/mL,用生長培養(yǎng)基稀釋制備)37 ℃下處理72 h。處理結(jié)束后吸除舊的培養(yǎng)基,加入100 μL 1.0 mg/mL 的MTT溶液,37 ℃下孵育4 h,孵育完后加入150 μL的DMSO,使用多功能酶標(biāo)儀測定490 nm處其OD值。按照下列公式計算增殖抑制率:

式中:At為樣品組OD值;Ac為對照組OD值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 4種谷物酚類提取物中TPC及TFC的含量

4種谷物純化后TPC和TFC含量如表1所示。由表中可知,不同谷物中TPC和TFC含量之間均存在顯著差異(p<0.05)。其中TPC含量在63.37～465.66 GAE mg/100 g dw之間,而TFC 含量介于58.79～930.42 RTE mg/100 g dw之間。TPC和TFC含量從高到低均依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。其中蕎麥的TPC和TFC含量均顯著高于其他三種谷物提取物(p<0.05),大麥和水稻的TPC和TFC含量之間均無顯著差異,而小麥的TPC和TFC均最低。

表1 4種谷物酚類提取物中總酚和總黃酮含量Table 1 Total polyphenol and flavnoid contents of four grian extracts

2.2 4種典型谷物中酚類化合物組成的初步鑒定

2.2.1 HPLC分析 圖1為4種谷物酚類化合物的HPLC圖,從圖可見在本分析條件下4種谷物酚類化合物均能很好的分離。

圖1 四種谷物的HPLC圖Fig.1 Chromatogram of four grain extracts注:A.蕎麥;B. 大麥;C. 水稻;D.小麥。

2.2.2 酚類化合物的MS分析 基于其保留時間和MS數(shù)據(jù)并結(jié)合參考文獻(xiàn)[19],從蕎麥中成功鑒定出15種酚類化合物,見表2。蕎麥中的酚類化合物主要為黃酮類化合物及其衍生物。其中,A2,A3,A4,A5,A7,A8,A9和A11被鑒定為黃烷-3-醇類。黃烷-3-醇(flavan-3-ol)屬于黃烷醇類化合物,主要包括兒茶素、表兒茶素及其衍生物,是黃酮類化合物中非常重要的一類物質(zhì)。A12和A13的[M-H]-和MS2均相同,但是保留時間不同,這說明兩者屬于同分異構(gòu)體。大麥、小麥和水稻中的酚類化合物明顯少于蕎麥?；谄浔Ａ魰r間和MS數(shù)據(jù)并結(jié)合參考文獻(xiàn)[19],在大麥、小麥、水稻提取物中分別成功鑒定出5、3、4種酚類化合物,見表2。

表2 4種谷物提取物中酚類化合物的HPLC-MS分析Table 2 Identification of phenolic compounds of buckwheat

從表2中可見,3種谷物中均含有黃烷-3-醇類化合物(B2、B4、C1、C2、D1)。而大麥和小麥都屬于麥類,均含有芹菜素的衍生物(B3、D2、D3),其中D2和D3的[M-H]-和MS2相同,而保留時間不同,屬于同分異構(gòu)體。

2.3 四種谷物酚類提取物的抗氧化性

由于化學(xué)分析法檢測抗氧化能力的局限性,一般使用兩種或兩種以上具有不同氧化機(jī)制的檢測方法分析抗氧化能力。

2.3.1 還原能力分析 通過測定在4種谷物酚類提取物存在下,Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+的情況判定其還原能力。由圖2能夠看出,4種谷物酚類提取物均具有一定還原能力,且存在劑量依賴效應(yīng)。同時,我們還發(fā)現(xiàn)不同種類的谷物之間,還原能力有著顯著差異(p<0.05)。蕎麥的還原能力高于VC,當(dāng)樣品濃度為200 μg/mL時,OD700值為0.897。而小麥的還原能力最弱,樣品濃度為200 μg/mL,OD700值僅為0.582。綜上,四種谷物酚類提取物的還原能力強(qiáng)弱依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。

圖2 4種谷物酚類提取物還原能力Fig.2 Reducing power of four grain extracts

2.3.2 DPPH自由基清除能力 DPPH·比較穩(wěn)定,可以長時間保存,廣泛應(yīng)用于測定抗氧化劑的自由基清除能力,從而判斷其抗氧化活性。由圖3能夠發(fā)現(xiàn),四種谷物酚類提取物均具有一定的DPPH·清除能力,DPPH·清除率隨著樣品濃度的增加前期顯著增加,而后清除率逐步趨于穩(wěn)定。同時,我們還發(fā)現(xiàn)不同種類的谷物之間,DPPH·清除能力有著顯著差異(p<0.05)。其中,蕎麥的DPPH·清除能力最高,200 μg/mL時,蕎麥的DPPH·清除率達(dá)到86.10%(同濃度VC的清除率為91.00%)。而小麥對DPPH·清除能力最弱,200 μg/mL時,清除率僅為39.21%。綜上,四種谷物酚類提取物的DPPH·清除能力強(qiáng)弱順序依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。

圖3 4種谷物酚類提取物的DPPH·清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging activity of four grain extracts

2.3.3 4種谷物酚類提取物對Caco-2細(xì)胞增殖的抑制作用 在活細(xì)胞中,MTT與細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶作用被還原成深紫色結(jié)晶物甲臜,并堆積在細(xì)胞中,含量與活細(xì)胞的數(shù)目成正比,但是在死細(xì)胞中不能產(chǎn)生發(fā)生這種反應(yīng)。從圖4可以看出,4種谷物酚類提取物均具有一定的抗Caco-2細(xì)胞增殖的能力,且存在劑量依賴效應(yīng)。其中,蕎麥對Caco-2細(xì)胞增殖的抑制能力最強(qiáng),當(dāng)樣品濃度為100 μg/mL時,抑制率可達(dá)55.62%。這4種谷物在低濃度(20～40 μg/mL)時抗Caco-2細(xì)胞增殖活性較弱,在高濃度(100 μg/mL)時,4種谷物酚類提取物的抗Caco-2細(xì)胞增殖活力大小依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。

圖4 4種谷物酚類提取物抗Caco-2細(xì)胞增殖能力Fig.4 Inhibition effects of four grain extracts on Caco-2 cells proliferation

2.4 4種谷物酚類物質(zhì)與抗氧化和抗癌細(xì)胞增殖活性的相關(guān)性

由表3能夠看出,TPC和TFC與抗氧化、抗癌細(xì)胞增殖之間存在一定的相關(guān)性?？偡雍亢涂傸S酮含量與還原能力之間的相關(guān)性良好,分別達(dá)到0.933,0.960,酚類化合物與DPPH·清除能力之間也具有一定的相關(guān)性。同時,抗氧化活性與抗癌細(xì)胞增殖能力之間也具有較強(qiáng)的相關(guān)性(與DPPH·清除能力 r=0.987,與還原能力r=0.925),其中抗癌細(xì)胞增殖活性與DPPH·清除能力之間的相關(guān)性系數(shù)存在顯著性關(guān)系(p<0.05)。

表3 谷物酚類提取物中總酚和總黃酮含量與其抗氧化和抗癌細(xì)胞增殖能力的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of total phenolic contents,flavnoid contents,antioxidant activity and anti-cancer activity

3 結(jié)論

4種谷物后酚類化合物(TPC和TFC)的含量從高到低的順序依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。從4種谷物中確定了21種酚類化合物,其中蕎麥中酚類化合物種類較多。4種谷物酚類化合物均具有一定的抗氧化和抗Caco-2細(xì)胞增殖活性的能力,而且存在劑量依賴關(guān)系;其酚類化合物的含量與其抗氧化活性和抗Caco-2細(xì)胞增殖活性之間以及抗氧化活性與抗Caco-2細(xì)胞增殖活性之間均具有較好的相關(guān)性。

植物酚類化合物具有多種生理活性,如抗過敏、抗炎、抑制微生物、抗氧化、抗腫瘤等作用,并且具有天然、高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)。因此,植物酚類化合物在食品、藥品、化妝品行業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景。谷物是東方人膳食結(jié)構(gòu)中的重要組成部分,且酚類物質(zhì)含量豐富。然而,目前國內(nèi)外有關(guān)植物酚類化合物的研究多集中于果蔬和茶葉方面,有關(guān)谷物酚類化合物及其生理活性方面(特別是抗癌能力方面)的研究相對較少,本文正是基于這種背景下對4種典型谷物中的酚類化合物進(jìn)行了研究,為谷物酚類化合物的深入研究提供參考。