白及溶膠中植物蛋白的定性定量方法研究

車向前，陳 芳，常明泉*，陳 林

0 引言

白及溶膠是制備復(fù)方白及乳膏的前體原料，該溶膠是從蘭科植物白及塊莖中提取、脫色后制備而成[1]。復(fù)方白及乳膏具有軟化角質(zhì)、促進(jìn)細(xì)胞生長、抗氧化、保濕潤膚的功效[2-3]，用于治療黃褐斑、干性皮炎、皮膚皸裂，也可用于魚鱗病、銀屑病的輔助治療[4]。白及可用于上消化道止血、抗?jié)?、肺結(jié)核、外用抗皸裂，也用于腫瘤的栓塞治療[5]，目前，針對(duì)白及多糖的研究多集中于提取工藝、純化工藝[6]，而對(duì)其中植物蛋白的研究僅局限于將其作為雜質(zhì)去除。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些植物蛋白除具有動(dòng)物蛋白的作用外，還具有較好的藥理活性，具有抗氧化、清除皮膚自由基的功能，該作用能抑制黃褐斑的生長，減退黃褐斑。復(fù)方白及乳膏能使黃褐斑減退并抑制其生長，可能與其含有一定量的植物蛋白有關(guān)[7]，為明確其藥理作用和活性成分，更好地控制復(fù)方白及乳膏的質(zhì)量，本文應(yīng)用硝酸硝化顯色法、色譜鑒別法對(duì)白及溶膠中的植物蛋白進(jìn)行定性鑒別，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)其中的植物蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 TU-1901型分光光度儀(北京普析通通用儀器有限責(zé)任公司)；BCD-610W型冰箱(博西華家用電器有限公司,功率：1.07 kW)；KM-410C型超聲震蕩儀(廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，40 kHz)；WE-AS-10型實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)(深圳市宏森環(huán)保科技有限公司，功率：300 W)；XPE-分析天平(梅特勒-托利多公司，精度0.1 mg)；MH-1000型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司，300 W)；試管架(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，13×50)；玻璃試管(20 ml、10 ml)。

1.2 試藥 白及溶膠(太和醫(yī)院自制，批號(hào)：20170322、20170410、20170416)；牛血清蛋白對(duì)照品(中檢院，批號(hào):160427-203942,25.0 mg/瓶)；考馬斯亮藍(lán)G-250(購自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，CBB，批號(hào)：6401-58-1)；乙醇(武漢市中天化工有限責(zé)任公司，批號(hào):20161225，分析純)；85%磷酸(武漢市中天化工有限責(zé)任公司，批號(hào):20161212，分析純)；85%濃硝酸(武漢市中天化工有限責(zé)任公司，批號(hào):20160701，分析純)；NaCl(沈陽試劑廠,批號(hào):2016010599，含量95%～100.05%，基準(zhǔn)試劑)；純化水(太和醫(yī)院新鮮)。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 硝化反應(yīng) 陽性對(duì)照：取濃度為1 mg/ml的蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液2 ml于試管中，滴加濃硝酸2滴，靜置2 min,觀察顏色變化，結(jié)果呈黃色。供試品溶液：取白及溶膠0.1 g于試管中，加純化水2 ml，超聲分散溶解，滴加濃硝酸2滴，靜置2 min,觀察顏色變化，結(jié)果呈黃色，與對(duì)照品反應(yīng)顏色一致。陰性對(duì)照：取純化水2 ml于試管中，滴加濃硝酸2滴，靜置2 min,觀察顏色變化，結(jié)果澄清，無黃色呈現(xiàn)。

2.1.2 色譜鑒別 陽性對(duì)照：取濃度為10 mg/ml的蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液5 ml，加入雙縮脲試劑5 ml，搖蕩均勻，顯紫色；供試品溶液:取白及溶膠10 g,加純化水10 ml，超聲溶解，過濾，收集濾液在水浴上蒸發(fā)至5 ml，加入雙縮脲試劑5 ml，搖蕩均勻，顯紫色；陰性樣品溶液:取純化水5 ml，加入雙縮脲試劑5 ml，搖蕩均勻，溶液呈淺藍(lán)色，無紫色出現(xiàn)。取上述3種染色液，以相應(yīng)試劑為空白，在紫外分光光度儀上于400～700 nm波長處掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在540 nm處均有最大吸收峰，陰性樣品溶液在該波長處無最大吸收。

2.2 定量檢測(cè)

2.2.1 溶液的制備 ①0.15 mol/L NaCl溶液的制備：精密稱取0.438 7 g NaCl于50 ml容量瓶中，加純化水溶解，定容,即得。②考馬斯亮藍(lán)染色液的制備:精密稱取考馬斯亮藍(lán)50 mg溶于25 ml乙醇中，加入磷酸50 ml，混合，加純化水稀釋至500 ml，即得。③蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取牛血清蛋白對(duì)照品10 mg，置10 ml容量瓶中，加純化水溶解，定容，即得1.0 mg/ml蛋白質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液，該溶液置冰箱中低溫保存(4 ℃)，取該溶液0.2 ml于試管中，加0.15 mol/L NaCl溶液至2.0 ml，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液10.0 ml，混勻，在室溫放置5 min，使其反應(yīng)充分，即得。④樣品溶液的制備:取白及溶膠0.1 g于試管中，加0.15 mol/L NaCl溶液至2.0 ml,超聲溶解，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液10.0 ml，混勻，放置5 min,使其反應(yīng)充分，即得。⑤空白樣品溶液的制備:精密吸取0.15 mol/L NaCl溶液2 ml于試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液10.0 ml混勻，在室溫放置5 min,使其反應(yīng)充分，即得。

2.2.2 測(cè)定波長的選擇 分別取“2.2.1”項(xiàng)下的蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液、樣品溶液和空白樣品溶液，在分光光度儀上于500～700 nm波長處掃描，記錄掃描圖，結(jié)果除空白樣品溶液外，蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液、樣品溶液在595 nm處都有最大吸收，設(shè)定595 nm為測(cè)定波長，掃描圖見圖1。

圖1 紫外掃描圖

2.2.3 曲線方程的建立 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下濃度為1.0 mg/ml的蛋白質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于10 ml試管中，每管加0.15 mol/L的NaCl溶液至1.0 ml，混勻，分別取0.1 ml于對(duì)應(yīng)編號(hào)的新試管中，分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5.0 ml混勻，放置5 min,使其反應(yīng)充分，即得每毫升含蛋白質(zhì)對(duì)照品為3.92、7.84、11.76、15.69、19.61 μg的溶液,取各溶液分別在設(shè)定波長處測(cè)定吸收度，讀數(shù)3次，取均值，用濃度值作為橫坐標(biāo)，用測(cè)得的吸收度值作為縱坐標(biāo)，制定曲線方程：Y=0.036 X-0.000 5，r=0.999 5,蛋白質(zhì)對(duì)照品在3.92～19.61 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下的蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液和空白樣品溶液，在設(shè)定波長處連續(xù)測(cè)定吸光度5次，結(jié)果RSD為0.77%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下經(jīng)染色后的蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液，在設(shè)定波長處于0、1、3、6 h測(cè)定，記錄吸光度值，結(jié)果RSD為1.89%，表明蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行精密稱取白及溶膠0.1 g于試管中，共5份，按“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液制備方法制備溶液，取“2.2.1”項(xiàng)下的空白樣品溶液，在設(shè)定波長處測(cè)吸光度，計(jì)算每份樣品的含量，結(jié)果RSD為1.34%。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的白及溶膠(批號(hào)：20170410)0.05 g，共9份，每3份為1組，分別按樣品含量的80%、100%、120%加入蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液的方法制備，取該項(xiàng)下的空白樣品溶液，在設(shè)定波長處測(cè)吸光度，計(jì)算各樣品溶液的含量，回收率計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 白及溶膠中植物蛋白回收率實(shí)驗(yàn)表(n=9)

2.2.8 含量測(cè)定 精密稱取白及溶膠0.1 g(批號(hào)：20170322、20170410、20170416)于試管中，每個(gè)批號(hào)各3份，按“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，取該項(xiàng)下的空白樣品溶液，于設(shè)定波長處分別測(cè)定各份樣品溶液的吸光度值，結(jié)果見表2。

表2 白及溶膠中植物蛋白含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

植物蛋白中具有苯環(huán)的氨基酸結(jié)構(gòu)，這類物質(zhì)遇濃硝酸生成黃色化合物，既硝化現(xiàn)象[8]，利用該原理可以對(duì)白及溶膠中的植物蛋白進(jìn)行定性鑒別。蛋白質(zhì)分子中含有很多似雙縮脲結(jié)構(gòu)肽鍵，雙縮脲試劑是一個(gè)藍(lán)色的含銅堿性試劑，能與蛋白質(zhì)中的肽鍵形成紫色的絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，雙縮脲試劑染色后的含蛋白質(zhì)溶液在紫外可見光譜為540 nm的波長處有最大吸收[9]，應(yīng)用該原理可以對(duì)白及溶膠中的植物蛋白進(jìn)行色譜鑒別。白及溶膠溶解液蒸發(fā)是為了縮小體積提高濃度，增加染色時(shí)的靈敏度。

考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合后立即呈現(xiàn)藍(lán)色。該溶液在紫外分光光度儀上在一定的波長范圍內(nèi)具有最大吸收,在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)與染色劑的結(jié)合量與測(cè)定波長的吸光度值成正比[10]，因而采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定白及溶膠中的植物蛋白含量。

白及溶膠中不僅有多糖、植物蛋白，還有植物色素等物質(zhì)，植物色素可能也產(chǎn)生一定的光密度值，因此，在配制樣品時(shí)，應(yīng)使蛋白質(zhì)濃度在0.1 mg/ml以內(nèi)，必要時(shí)適當(dāng)增加考馬斯亮藍(lán)染色液的用量，以保證與蛋白質(zhì)染色反應(yīng)完全，減小其他成分對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定可能產(chǎn)生的影響。酸堿對(duì)植物蛋白的測(cè)定會(huì)有一定影響，樣品配制時(shí)加入0.15 mol/L NaCl溶液稀釋，可緩沖其影響。在測(cè)定實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)把本實(shí)驗(yàn)所用器具用鉻酸鉀清潔液浸泡、用純化水清洗干凈，并避免使用石英吸收池，防止用具不潔對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾，每次測(cè)定完畢用乙醇清洗比色皿，然后用純化水清洗，以免考馬斯亮藍(lán)染色液在比色皿上存在殘留。