李奕璇
結(jié)腸癌好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處,具有浸潤(rùn)能力強(qiáng)、惡性程度高的特點(diǎn)[1]。結(jié)腸癌早期癥狀不明顯,容易漏診,一旦確診,癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重威脅患者的身體健康和生命安全。研究表明,腫瘤血管的生成在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2],因此,采取有效的措施抑制腫瘤血管生成可以有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移,進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。白花丹醌(Plumbagin)是從百花丹(Phum bago zeylanicaL.)中提取出來(lái)的生物活性物質(zhì),對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[3]。有研究表明,白花丹醌能夠通過(guò)抑制腫瘤血管的生成抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[4],然而白花丹醌對(duì)結(jié)腸癌血管生成的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。貝伐單抗能夠與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)結(jié)合并阻斷其活性,進(jìn)而抑制新血管生成[5]。本研究以貝伐單抗為陽(yáng)性藥物,探究中藥單體白花丹醌對(duì)結(jié)腸癌血管生成和VEGF/VEGFR2信號(hào)通路的影響。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株 健康雄性BALB/c裸鼠70只,SPF級(jí),4~5周齡,體重15~20 g,購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,許可證號(hào):SYXK(京)2015-0046。結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。
1.1.2 主要材料與儀器 白花丹醌(美國(guó)Sigma公司);貝伐單抗(批號(hào):S20100023)購(gòu)自瑞士羅氏公司;TRIzol reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物(大連)有限公司;TaqDNA聚合酶購(gòu)自英國(guó)NEB公司;兔抗鼠VEGF、VEGFR2多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;3K15超低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司;超凈臺(tái)購(gòu)自上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司;引物序列由深圳華大基因合成。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底85%左右時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng)和細(xì)胞凍存。
1.2.2 裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型制備 隨機(jī)選取10只裸鼠為假手術(shù)組,其余裸鼠按照文獻(xiàn)資料[6]建立結(jié)腸癌移植瘤模型,將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29制成細(xì)胞懸浮液,調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106/ml,用75%的酒精將裸鼠右前肢腋下消毒,用微量注射器將細(xì)胞懸浮液緩慢注射進(jìn)裸鼠右前肢腋下,200 μl/只,假手術(shù)組注射等量容積的生理鹽水,以造模后第3天可肉眼觀察到米粒樣移植瘤作為模型構(gòu)建成功的標(biāo)志。
1.2.3 動(dòng)物分組 入選50只造模成功的裸鼠,隨機(jī)分成5組:模型組、貝伐單抗組、白花丹醌低劑量組、白花丹醌中劑量組、白花丹醌高劑量組,每組10只。貝伐單抗組:腹腔注射5 mg/kg貝伐單抗;白花丹醌低劑量組:腹腔注射2 mg/kg白花丹醌;白花丹醌中劑量組:腹腔注射4 mg/kg白花丹醌;白花丹醌高劑量組:腹腔注射6 mg/kg白花丹醌;假手術(shù)組及模型組給予等量容積生理鹽水,持續(xù)治療4周。
1.2.4 六組裸鼠移植瘤體積的比較 持續(xù)治療4周后,將各組裸鼠脫頸椎處死,在無(wú)菌條件下分離出完整瘤組織,用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)徑(a)與短徑(b),計(jì)算得出腫瘤體積,V=1/2ab2。
1.2.5 免疫組化染色檢測(cè)移植瘤微血管密度(MVD) 選取與正常組織交界處的腫瘤組織(假手術(shù)組選取造模時(shí)注射部位的組織)制作石蠟切片(切片厚度小于5 μm),二甲苯脫蠟后進(jìn)行梯度脫水,用PBS溶液洗滌2~3次,將組織切片在92~98 ℃條件下存放20 min進(jìn)行抗原修復(fù),滴加正常山羊血清中和非特異性反應(yīng)后,在組織玻片上滴加稀釋的兔抗鼠CD43多克隆抗體,于4 ℃過(guò)夜放置,用PBS溶液洗滌2~3次,復(fù)溫后滴加生物素標(biāo)記的二抗,于避光條件下室溫孵育20 min,用甘油封片后,于顯微鏡下觀察6組裸鼠移植瘤中微血管的密度。判斷標(biāo)準(zhǔn):染色后呈棕色或者褐色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均可記為1個(gè)血管,以200倍視野下平均微血管數(shù)記為MVD。
1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平 取6組裸鼠移植瘤組織,用TRIzol reagent提取其總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)成cDNA,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)VEGF、VEGFR2的cDNA序列設(shè)計(jì)引物,以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR。PCR的反應(yīng)體系為:5×緩沖液 10 μl,TaqDNA聚合酶 1 μl,上游引物F 2 μl,下游引物R 2 μl,10 mmol dNTP mix 1 μl,cDNA 1 μl,ddH2O 33 μl;PCR的反應(yīng)條件為:預(yù)變性:95 ℃ 5 min,變性:95 ℃ 30 s,延伸:62 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。采用最大二階導(dǎo)數(shù)法(2-△△Ct)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)算VEGF、VEGFR2 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。
1.2.7 Western blot檢測(cè)移植瘤中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平 取6組裸鼠移植瘤組織,加入2 ml細(xì)胞裂解液,提取總蛋白,以GAPDH為內(nèi)參,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),每孔上樣體積20 μl,電泳結(jié)束后,半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min,分別滴加兔抗鼠VEGF、VEGFR2多克隆抗體,置于4 ℃下過(guò)夜,滴加二抗后37 ℃放置1 h。加入發(fā)光劑顯影,利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,并利用Gel-Pro analyzer4 軟件對(duì)SDS-PAGE電泳圖目的條帶進(jìn)行掃描,分析VEGF、VEGFR2表達(dá)水平。
2.1 裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型的鑒定 造模后第3天,模型組裸鼠的右前肢腋下可見(jiàn)米粒樣移植瘤,假手術(shù)組未見(jiàn)明顯異常,提示移植瘤模型構(gòu)建成功。
2.2 六組裸鼠移植瘤體積比較 假手術(shù)組裸鼠右前肢腋下沒(méi)有移植瘤形成,模型組移植瘤體積最大[( 2 012.58±406.32) mm3];貝伐單抗組移植瘤體積顯著小于模型組(P<0.05);白花丹醌高劑量組移植瘤體積與貝伐單抗組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);白花丹醌高劑量組移植瘤體積顯著小于白花丹醌低、中劑量組(P<0.05),且隨白花丹醌劑量增加,移植瘤體積顯著減小,呈劑量依賴性。見(jiàn)表1。
表1 六組裸鼠移植瘤體積比較
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與貝伐單抗組比較,&P<0.05;與白花丹醌低劑量組比較,△P<0.05;與白花丹醌中劑量組比較,▲P<0.05
2.3 免疫組化染色檢測(cè)移植瘤MVD 模型組移植瘤MVD顯著大于假手術(shù)組(P<0.05);貝伐單抗組移植瘤MVD顯著小于模型組(P<0.05);白花丹醌高劑量組移植瘤MVD與貝伐單抗組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),白花丹醌高劑量組移植瘤MVD顯著小于白花丹醌低、中劑量組(P<0.05),且隨白花丹醌劑量增加,移植瘤MVD顯著減小,呈劑量依賴性。見(jiàn)表2。
表2 六組裸鼠移植瘤MVD比較
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與貝伐單抗組比較,&P<0.05;與白花丹醌低劑量組比較,△P<0.05;與白花丹醌中劑量組比較,▲P<0.05
2.4 qRT-PCR檢測(cè)移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平 模型組移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05);貝伐單抗組移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05);白花丹醌高劑量組移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA與貝伐單抗組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),白花丹醌高劑量組移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA顯著小于白花丹醌低、中劑量組(P<0.05),且隨著白花丹醌劑量增加,移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平顯著下降,呈劑量依賴性。見(jiàn)表3。
表3 移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與貝伐單抗組比較,&P<0.05;與白花丹醌低劑量組比較,△P<0.05;與白花丹醌中劑量組比較,▲P<0.05
2.5 Western blot檢測(cè)6組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平 模型組移植瘤中VEGF、VEGFR2的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05);貝伐單抗組移植瘤中VEGF、VEGFR2的表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05);白花丹醌高劑量組移植瘤中VEGF、VEGFR2與貝伐單抗組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),白花丹醌高劑量組移植瘤中VEGF、VEGFR2顯著小于白花丹醌低、中劑量組(P<0.05),且隨白花丹醌劑量增加,移植瘤中VEGF、VEGFR2的表達(dá)水平顯著下降,呈劑量依賴性。見(jiàn)圖1、表4。
圖1 Western blot檢測(cè)六組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平
注:A.假手術(shù)組,B.模型組,C.貝伐單抗組,D.白花丹醌低劑量
組,E.白花丹醌中劑量組,F(xiàn).白花丹醌高劑量組
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與貝伐單抗組比較,&P<0.05;與白花丹醌低劑量組比較,△P<0.05;與白花丹醌中劑量組比較,▲P<0.05
結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,全球每年的結(jié)腸癌新增病例約為100萬(wàn),其中我國(guó)約占全球的20%[7]。目前結(jié)腸癌的治療方法主要包括手術(shù)治療和放、化療[8-10],手術(shù)治療對(duì)于早期結(jié)腸癌患者具有顯著療效,但對(duì)于已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中晚期結(jié)腸癌患者具有一定的局限性。放、化療具有很大的毒副作用,而且其不能從根本上解決癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的問(wèn)題。研究表明,腫瘤血管的生成與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2],因此,采取有效的藥物抑制腫瘤血管的生成,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。
祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為結(jié)腸癌中醫(yī)屬于“腸覃”、“積聚”、“鎖肛痔”的范疇,其發(fā)病原因主要包括腎虛、脾虛、濕熱、瘀滯等[11]。白花丹醌是從植物中提取的天然活性物質(zhì),具有抗炎、抗腫瘤和抗纖維化的作用[12]。謝金玲等[13]研究表明,白花丹醌能夠體外抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲,并通過(guò)調(diào)控HepG2細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。徐凱紅等[14]研究表明,白花丹醌能夠抑制白血病荷瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng),并能夠促進(jìn)移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡。Kawiak等[15]研究表明,白花丹醌能夠體外抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR3和BT474的增殖,并通過(guò)調(diào)控SKBR3和BT474細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)水平促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Yan等[16]研究表明,白花丹醌能夠抑制乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng),抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231SArfp在骨微環(huán)境中的生長(zhǎng),促進(jìn)移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡。賴力等[4]研究表明,白花丹醌能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移,并能夠抑制腫瘤血管生成,這一結(jié)果在前列腺癌裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。然而,白花丹醌對(duì)結(jié)腸癌血管生成的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探究中藥單體白花丹醌對(duì)結(jié)腸癌血管生成和VEGF/VEGFR2信號(hào)通路的影響。貝伐單抗能夠與VEGF結(jié)合并阻斷其活性,進(jìn)而抑制新血管生成[5],因此,本研究以貝伐單抗為陽(yáng)性藥物,結(jié)果表明,白花丹醌能夠抑制裸鼠結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)和腫瘤微血管生成,并呈現(xiàn)劑量依賴性。
白花丹醌能夠抑制裸鼠結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)和腫瘤微血管生成,但其作用機(jī)制尚未完全明確。VEGF和VEGFR2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá),能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,進(jìn)而促進(jìn)新血管的生成[17]。王偉等[18]研究表明,VEGF/VEGFR2信號(hào)通路在腫瘤新血管的生成中發(fā)揮著重要作用,因此,VEGF和VEGFR2可以作為抑制腫瘤血管生成的靶位點(diǎn)。覃雪峰等[19]報(bào)道,藥物靶向作用于VEGF/VEGFR2信號(hào)通路,進(jìn)而抑制裸鼠肝癌移植瘤新血管的生成,降低移植瘤組織微血管密度。余仔軍等[20]研究顯示,VEGF/VEGFR2信號(hào)通路在胃癌的治療中也發(fā)揮著重要的作用。章婷婷等[21]研究發(fā)現(xiàn),VEGF/VEGFR2信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤新血管的生成密切相關(guān),在膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。然而,白花丹醌對(duì)VEGF/VEGFR2信號(hào)通路的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究表明,白花丹醌能夠抑裸鼠結(jié)腸癌移植瘤中VEGF和VEGFR2的表達(dá)水平,并呈現(xiàn)劑量依賴性。
綜上所述,中藥單體白花丹醌能夠抑制結(jié)腸癌移植瘤裸鼠血管生成,推測(cè)這一作用是通過(guò)調(diào)控VEGF/VEGFR2信號(hào)通路活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的,為結(jié)腸癌的臨床治療提供一定理論基礎(chǔ)。