擬南芥AAP6基因的克隆與轉(zhuǎn)化馬鈴薯的研究

李 倩，王 罡，張松皓，楊 丹，王昱蓉，

季 靜1，安 婷1，李 辰1，馬志剛3，史懷宇1，關(guān)春峰1，劉 玉4

(1. 天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；2. 天津市天大天福生物技術(shù)有限公司，天津 300072；3. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；4. 電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610054 )

氨基酸是植物新陳代謝的重要組成部分，不僅僅是蛋白質(zhì)的成分，也是植物重要的次生代謝產(chǎn)物的前體和有機(jī)氮的載體．氨基酸作為酶和蛋白質(zhì)的組成成分，對(duì)植物的新陳代謝具有不可替代的作用．植物體內(nèi)種子貯藏蛋白的積累在很大程度上也取決于氨基酸的供應(yīng)．氨基酸透性酶(amino acid permease，AAP)對(duì)植物體吸收氨基酸的過(guò)程，氨基酸在植物中細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間以及源器官到庫(kù)器官之間的分配過(guò)程均發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]．氨基酸透性酶是研究比較多的一類氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[2]．在植物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是擬南芥氨基酸通透酶1(AtAAP1)[3-4]．近年來(lái)，在擬南芥等植物中發(fā)現(xiàn)了一系列新的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并進(jìn)行了相關(guān)研究．研究報(bào)道，AtAAP1和 AtAAP5 在根系吸收氨基酸過(guò)程中具有重要作用[5-8]；AtAAP2和 AtAAP6主要參與氨基酸在木質(zhì)部與韌皮部的轉(zhuǎn)運(yùn)，而 AtAAP2、AtAAP3、AtAAP5有助于氨基酸在韌皮部的裝載，并且在微管組織中表達(dá)；AtAAP1和AtAAP8參與了氨基酸在種子中的卸載過(guò)程[1,9-10]．已有研究報(bào)道 AtAAP8 僅僅在種子及與其相關(guān)聯(lián)的填充物中表達(dá)[11]．最近的一項(xiàng)研究采用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AtAAP8 也在“源”葉的韌皮部表達(dá)，揭示了該蛋白的新作用，進(jìn)一步的生理分析指出，對(duì)種子發(fā)育的影響更可能是由于“源”葉韌皮部的氨基酸裝載減少，而不是種子“庫(kù)”中氨基酸的輸入減少，從而導(dǎo)致了種子“庫(kù)”的發(fā)育減弱[12]．

近年來(lái)，基于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在長(zhǎng)距離氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，如葉到根或種子，這些基因可能是農(nóng)作物改良的良好靶標(biāo)．早期已有學(xué)者嘗試?yán)冒被徂D(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行作物改良，了解馬鈴薯塊莖中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)情況．將馬鈴薯葉中的氫離子氨基酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 StAAP1反義表達(dá)抑制后，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的塊莖中除天冬氨酸外的所有氨基酸含量均有所下降，導(dǎo)致馬鈴薯塊莖中氨基酸含量下降約50%,，從而致使總氮含量減少了 10%～15%,，但是由于 C/N比例的升高，淀粉含量并沒(méi)有受到影響，更有趣的是對(duì)植物的光合作用和產(chǎn)量沒(méi)有大的影響，這些均表明 StAAP1在氨基酸的長(zhǎng)距離運(yùn)輸中起到了非常重要的作用[13]．

馬鈴薯微型薯具有體積小、誘導(dǎo)周期短、生產(chǎn)不受季節(jié)限制、易儲(chǔ)藏、可用于優(yōu)良種質(zhì)的保存等明顯優(yōu)勢(shì)．生物信息學(xué)分析表明，馬鈴薯氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StAAP1 與擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 AtAAP6同源性最高[13]．但AtAAP6基因在馬鈴薯中的遺傳轉(zhuǎn)化未見(jiàn)報(bào)道．而且馬鈴薯(Solanum tuberosum)是世界第3大糧食作物和最重要的非禾本科作物．其塊莖營(yíng)養(yǎng)豐富全面，含有人體必需的全部 7大類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，隨著加工業(yè)的迅速發(fā)展和人們對(duì)食物營(yíng)養(yǎng)的重視，迫切需要選育出更抗病、更耐逆、更高產(chǎn)、更優(yōu)質(zhì)和專用的馬鈴薯新品種[14]．基于以上研究基礎(chǔ)，筆者從擬南芥中克隆了 AtAAP6基因，構(gòu)建了能過(guò)表達(dá) AtAAP6基因的植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300-AtAAP6，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化馬鈴薯[15]，得到轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，接著利用馬鈴薯微型薯誘導(dǎo)方法[16]，成功獲得了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯微型薯．這些工作均為進(jìn)一步闡明擬南芥氨基酸透性酶基因(AtAAP6)的功能，提高馬鈴薯塊莖中的氨基酸以及貯藏蛋白的含量等提供了研究基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料：擬南芥為哥倫比亞生態(tài)型(Arabidopsis thaliana L.，col-0)，馬鈴薯為“早大白”品種．大腸桿菌菌株 DH5α用于載體構(gòu)建和分子克隆操作，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pMD19-T購(gòu)自 TaKaRa生物工程公司(中國(guó)，大連)．pCAMBIA2300質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存．Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒為T(mén)IANGEN 公司(中國(guó)，北京)產(chǎn)品．各種限制性內(nèi)切酶、RNAase、T4 連接酶均為New England Biolabs公司產(chǎn)品．不同種類抗生素均購(gòu)自天津市天大天福生物技術(shù)有限公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取

取擬南芥幼苗約 100,mg，放入液氮速凍后，快速、充分研磨成細(xì)粉末狀，用 TRIZOL法提取擬南芥總 RNA[17]，－80,℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 第一鏈cDNA的合成

用 cDNA一鏈合成試劑盒(Promega)合成各個(gè)樣品 RNA的第一鏈 cDNA，操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行．之后置于－20,℃ 冰箱保存反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA．

1.2.3 AtAAP6基因的克隆

根據(jù) Primer5.0 設(shè)計(jì)引物(AtAAP6-F/R)進(jìn)行RT-PCR，上游引物帶有 XhoI酶切位點(diǎn)，下游引物帶有XbaI酶切位點(diǎn)．

AtAAP6-F：

GCCTCGAGATGGAGAAGAAGAAGAGCATGT

AtAAP6-R：

GCTCTAGACTAAGGAGCCTGGAAAGGCTTG

取 1,μL一鏈產(chǎn)物為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，25,μL體系中包括：10×PCR 緩沖液，0.2,mmol/L dNTPs，1.5,mmol/L MgCl2，上、下游引物各 0.2,μmol/L，1,U Taq DNA聚合酶(Promega)．PCR反應(yīng)的條件為94,℃預(yù)變性 5,min；94,℃ 30,s，58,℃ 30,s，72,℃1.5,min，32個(gè)循環(huán)；72,℃延伸 10,min．利用 1%, 的瓊脂糖凝膠對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，將目的片段進(jìn)行回收，并連接到pMD19-T載體，經(jīng)XhoI/XbaI進(jìn)行雙酶切鑒定后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序．

1.2.4 pCAMBIA2300-AtAAP6植物表達(dá)載體的構(gòu)建

選擇測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，利用TIANGEN質(zhì)粒提取試劑從大腸桿菌中進(jìn)行質(zhì)粒提?。?XhoI/XbaI對(duì) pMD19-T-AtAAP6質(zhì)粒和植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切．酶切 體 系 為 20,μL ，質(zhì) 粒 10,μL ，XhoⅠ1,μL ，XbaⅠ1,μL，10×Buffer 2,μL，ddH2O 6,μL，置于 37,℃條件下酶切反應(yīng) 1,h，1%,瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收目的基因片段和載體片段．將 AtAAP6 基因片段與載體片段在 T4 連接酶作用下，16,℃ 過(guò)夜連接(連接體系為 10,μL，包括 10×T4,DNA Buffer 1,μL，T4,DNA 連接酶 1,μL，pCAMBIA2300 載體片段5,μL，AtAAP6 基因片段 3,μL)．熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切驗(yàn)證，植物表達(dá)載體示意見(jiàn)圖1．

圖1 T-DNA區(qū)的載體圖譜示意Fig.1 Schematic representations of the T-DNA regions of transformation vector

1.2.5 馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化

(1) 農(nóng)桿菌菌體活化

將含目的基因的農(nóng)桿菌加入到 LB液體培養(yǎng)基中，28,℃ 活化培養(yǎng)48,h．轉(zhuǎn)化當(dāng)天按1∶100的比例接入三角瓶中 LB液體培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)至 OD600＝0.6．

選生長(zhǎng)發(fā)育良好的無(wú)菌馬鈴薯苗，切取大小約為0.5,mm×0.5,mm 的葉盤(pán)作為轉(zhuǎn)化外植體．將擴(kuò)大培養(yǎng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入 50,mL滅菌離心管中，常溫下6,000,r/min離心沉淀菌體．用等體積侵染培養(yǎng)基懸浮沉淀的菌體．將切好的葉盤(pán)加入到重懸的菌液中，輕輕振蕩侵染 15,min．倒掉菌液，用滅過(guò)菌的雙蒸水沖洗葉盤(pán)(2～3次)，再用滅過(guò)菌的濾紙將葉盤(pán)表面多余的菌液盡量吸干，接著在共培養(yǎng)基(MS＋蔗糖3%＋6-BA 2.0,mg/L＋NAA 0.2,mg/L＋瓊脂0.7%,)上表面鋪一層滅過(guò)菌的濾紙，然后將葉盤(pán)接到該培養(yǎng)基上，置于 28,℃的條件下，進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為2,d．暗培養(yǎng)結(jié)束后，將葉盤(pán)接種到愈傷誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基(MS＋蔗糖3%＋6-BA 2.0,mg/L＋NAA 0.2,mg/L＋頭孢霉素 500,mg/L＋Basta 0.7,mg/L＋瓊脂 0.7%,)中，在25,℃、16,h光照/8,h黑暗的光周期培養(yǎng)條件下進(jìn)行篩選培養(yǎng)．每?jī)傻饺芨鼡Q一次培養(yǎng)基．將篩選得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接至芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基(MS＋蔗糖 3%＋6-BA 2.0,mg/L＋ZT 2.0,mg/L＋頭孢霉素500,mg/L＋Basta 0.7,mg/L＋瓊脂 0.7%,)中進(jìn)行篩選培養(yǎng)．將生長(zhǎng)至 2,cm左右的幼芽接種到生根培養(yǎng)基(MS＋蔗糖 3%,＋矮壯素 500,mg/L＋頭孢霉素500,mg/L＋Basta 0.7,mg/L＋瓊脂 0.7%,)中，在 25,℃、16,h光照/8,h黑暗的光周期培養(yǎng)條件下進(jìn)行生根篩選培養(yǎng)．

1.2.6 馬鈴薯轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的分子檢測(cè)

經(jīng)過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程得到的含有抗生素抗性馬鈴薯植株，采用改進(jìn)的 CTAB法提取有抗性的馬鈴薯苗的 DNA[17-18]．利用 PCR方法檢測(cè)基因組中AtAAP6基因．利用目的基因特異引物(AtAAP6-F/R)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增檢測(cè)．基因擴(kuò)增程序?yàn)椋?4,℃ 5,min；94,℃ 30,s；58,℃ 30,s；72,℃ 1.5,min；32 個(gè)循環(huán)；72,℃ 延伸 10,min．

然后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確定目的基因在馬鈴薯中是否表達(dá)．取1,μL cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25,μL體系中包括：10×PCR 緩沖液，0.2,mmol/L dNTPs，1.5,mmol/L MgCl2，上、下游引物各 0.2,μmol/L，1,U Taq DNA聚合酶(Promega)．PCR反應(yīng)的條件為 94,℃ 預(yù)變性 5,min；94,℃ 30,s，58,℃ 30,s，72,℃1.5,min，32個(gè)循環(huán)；72,℃延伸 10,min．PCR 產(chǎn)物用1%,的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)．

1.2.7 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的微型薯誘導(dǎo)

將馬鈴薯無(wú)菌苗在含有 0.4,mg/L B9 的 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，20,d后，選取生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌馬鈴薯苗，切成含 2～3 個(gè)腋芽的莖段．置于微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為：MS＋蔗糖 8%,＋香豆素 9,mg/L＋I(xiàn)BA 0.1,mg/L＋NAA 0.1,mg/L＋活性炭0.15%,＋瓊脂粉 0.7%,．暗培養(yǎng)條件下，4,d左右后試管苗腋芽處膨大，13,d左右開(kāi)始有試管薯形成．

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥總RNA的提取

利用 TRIZOL法提取得到擬南芥幼苗的總RNA，用 1%,的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，3條條帶清晰，如圖2所示，從上到下依次為 28,SRNA、18,SRNA、5,SRNA，電泳結(jié)果表明總 RNA 完整性較好，純度較高，可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)．

圖2 野生型擬南芥總RNA的提取Fig.2 Total RNA extraction for wild-type Arabidopsis thaliana

2.2 擬南芥AAP6基因的克隆及序列分析

將提取的擬南芥總 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以 cDNA 作為模板，用 AtAAP6 基因特異性引物(AtAAP6-F/R)進(jìn)行 RT-PCR檢測(cè)，電泳檢測(cè)得到一條約為 1.5,kb的目的DNA條帶，如圖3所示，1～3 是以cDNA為模板擴(kuò)增目的基因，其中4是以水為模板進(jìn)行擴(kuò)增作為陰性對(duì)照，1、3均擴(kuò)增出目的條帶，2擴(kuò)增得到目的大小條帶與GenBank公布的目的片段大小一致．

拔出套管后，下鋼管至基巖面上0.5 m處注入水泥黏土漿液，水泥比重占20%，第一次將鋼管下至基巖面，注入黏土水泥漿，將孔內(nèi)清水頂出，直到孔口回漿為止，停20 min，孔內(nèi)漿面下降，第二次注漿，孔口溢出稠漿直至漿面不下降、孔口填滿為止。

圖3 以cDNA為模板擴(kuò)增AtAAP6基因Fig.3 PCR amplification for AtAAP6 gene using cDNA as template

將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，回收后的產(chǎn)物連接到 pMD19-T載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒的提取，得到質(zhì)粒 pMD19-T-AtAAP6．由圖4 可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，分別獲得了2.7,kb的載體片段和大約 1.5,kb的目的基因片段．雙酶切檢測(cè)結(jié)果顯示，已經(jīng)成功克隆得到AtAAP6 基因．

圖4 重組質(zhì)粒pMD19-T-AtAAP6的雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pMD19-T-AtAAP6

將克隆后的基因片段送至公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示，將克隆得到的基因序列與 GenBank中公布的已知序列進(jìn)行比對(duì)，如圖5 所示．比對(duì)結(jié)果表明，筆者從擬南芥中克隆的 AAP6 基因與 GenBank中發(fā)表的 AtAAP6基因(GenBank登錄號(hào)：NM_124341.4)核苷酸序列同源性達(dá)到 99.93%,，氨基酸序列同源性為 100%,，這表明擬南芥 AtAAP6 基因全長(zhǎng)克隆成功，由圖5可見(jiàn)，該基因共編碼 481 個(gè)氨基酸，蛋白大小約為 5.3×104,g/mol．

圖5 AtAAP6基因測(cè)序的DNA序列Fig.5 DNA sequencing of AtAAP6 gene

2.3 擬南芥AtAAP6基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建

用XhoI/XbaI對(duì)pMD19-T-AtAAP6 質(zhì)粒和植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切．將目的基因片段和 pCAMBIA2300載體大片段進(jìn)行回收，然后連接，獲得新的植物表達(dá)載體，將改造后的載體命名 pCAMBIA2300-AtAAP6．然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行質(zhì)粒提取，并將質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，如圖 6所示，圖 6中 1～5為重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證．經(jīng)過(guò)雙酶切驗(yàn)證，獲得了約為 1.5,kb大小的目的基因片段．通過(guò)測(cè)序分析驗(yàn)證，結(jié)果與 AtAAP6測(cè)序結(jié)果完全相同．證明pCAMBIA2300-AtAAP6植物表達(dá)載體已構(gòu)建成功．

圖6 重組質(zhì)粒pCAMBIA2300-AtAAP6 的雙酶切驗(yàn)證Fig.6 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pCAMBIA2300-AtAAP6

2.4 植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-AAP6轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將構(gòu)建成功的 pCAMBIA2300-AtAAP6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，用于后續(xù)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，挑取單克隆進(jìn)行目的基因 PCR檢測(cè)．如圖 7所示，1～12是以挑取的單克隆為模板進(jìn)行的PCR檢測(cè)，得到了1,446,bP大小的條帶，P作為陽(yáng)性對(duì)照，是以 pCAMBIA2300-AtAAP6 質(zhì)粒為模板進(jìn)行的 PCR，H2O是以水作為模板進(jìn)行的PCR檢測(cè)，作為陰性對(duì)照．電泳結(jié)果顯示，以挑取的單克隆為模板進(jìn)行 PCR，得到的條帶大小與陽(yáng)性對(duì)照一致，說(shuō)明新構(gòu)建的植物表達(dá)載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，保存菌種，用于后續(xù)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化．

圖7 農(nóng)桿菌菌落PCR檢測(cè)Fig.7 PCR detection for Agrobacterium colony

2.5 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的獲得及分子檢測(cè)

選生長(zhǎng)發(fā)育良好的無(wú)菌馬鈴薯苗，取大小約0.5,mm×0.5,mm 的葉盤(pán)進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，吸干其表面的菌液，并置于共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng) 2,d．暗培養(yǎng)結(jié)束后，將葉盤(pán)接種到愈傷誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中，在 25,℃、16,h光照/8,h黑暗的光周期培養(yǎng)條件下進(jìn)行篩選培養(yǎng)．每?jī)傻饺芨鼡Q一次培養(yǎng)基．將篩選得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接至芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，得到了抗性芽，如圖 8(a)所示．將生長(zhǎng)大小為 2,cm 左右的幼芽接種到生根培養(yǎng)基中，在 25,℃、16,h光照/8,h黑暗的光周期培養(yǎng)條件下進(jìn)行生根篩選培養(yǎng)．成功得到了含有抗生素抗性馬鈴薯植株，如圖 8(b)所示．

圖8 轉(zhuǎn)AtAAP6基因的馬鈴薯除草劑抗性苗的再生Fig.8 Solanum tuberosum herbicide resistant plants containing AtAAP6

采用 CTAB法提取有抗生素抗性的馬鈴薯苗的DNA．根據(jù)目的基因引物(AtAAP6-F/R)進(jìn)行PCR檢測(cè)．如圖 9所示，1～21是提取不同馬鈴薯抗性植株的 DNA為模板進(jìn)行的檢測(cè)，WT是非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯陰性對(duì)照，P是以質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)照，H2O是以水為模板的陰性對(duì)照，由電泳圖可以看出，在檢測(cè)的21個(gè)不同馬鈴薯株系中，有14個(gè)株系中檢測(cè)到了目的條帶，說(shuō)明目的基因 AtAAP6已成功插入到馬鈴薯基因組中，成功獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性馬鈴薯植株．

為驗(yàn)證 PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中AtAAP6 基因的轉(zhuǎn)錄水平，挑選10個(gè)株系，重新編號(hào)(1～10)，利用 AtAAP6 基因的特異引物 AtAAP6-F/R，以馬鈴薯的看家基因Stactin作為內(nèi)參基因，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，分析目的基因AtAAP6 在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達(dá)情況．如圖10所示，AtAAP6 基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中都有一定量的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并且各個(gè)株系的表達(dá)量也不同．其中 2、3、4、5、6、9 表達(dá)量較高，1和10表達(dá)量較低，7 和8 表達(dá)量中等．上述結(jié)果表明，AtAAP6 基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中進(jìn)行了正常的轉(zhuǎn)錄表達(dá)．

圖9 AtAAP6基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯抗性苗的PCR檢測(cè)Fig.9 PCR screening for AtAAP6 resistant transgenic Solanum plants

圖10 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的RT-PCR分析Fig.10 RT-PCR analysis of AtAAP6 transgenic Solanum plants

2.6 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的微型薯獲得

選取生長(zhǎng)健壯的馬鈴薯無(wú)菌苗，切成帶有 2～3個(gè)腋芽的莖段，置于微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行微型薯的誘導(dǎo)．20,℃ 暗培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，4,d后觀察發(fā)現(xiàn)，無(wú)菌苗腋芽處開(kāi)始出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，13,d后開(kāi)始形成微型薯，培養(yǎng)30,d后，得到生長(zhǎng)較好的馬鈴薯微型薯(見(jiàn)圖11)．

圖11 馬鈴薯微型薯Fig.11 Micro potato

3 討 論

植物體內(nèi)存在各種各樣的氨基酸，氨基酸作為植物體內(nèi)重要的有機(jī)氮化合物，在植物的生長(zhǎng)代謝過(guò)程中起著不可替代的作用，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物體內(nèi)或細(xì)胞間氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中扮演極其重要的角色，對(duì)于植物體內(nèi)氮素的代謝有著非常重要的作用[19]．

崔喜艷等[20]從擬南芥中克隆得到擬南芥氨基酸透性酶 1基因(AtAAP1)，并成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體與 pCAMBIA3300-AAP1，為在植物體內(nèi)過(guò)表達(dá)AtAAP1 基因，為增加作物體內(nèi)氨基酸的含量，從而提高作物中氮素的利用效率提供研究基礎(chǔ)．

近年來(lái)，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白逐漸成為農(nóng)作物改良的目標(biāo)載體．研究發(fā)現(xiàn)，在豌豆和蠶豆植株子葉薄壁細(xì)胞中利用過(guò)表達(dá) AAP型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(VfAAP1)的方法來(lái)增加胚中氨基酸的供應(yīng)，從而增加了蛋白含量[21].水稻中的 OsAAP6 主要是在根、葉和發(fā)育中的種子表達(dá)，對(duì)OsAAP6 過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)都證明，該基因?qū)ψ蚜５鞍缀看嬖谡{(diào)節(jié)作用[22]．

另外，有研究報(bào)道，在馬鈴薯中，StAAP1 在氨基酸從“源”器官到“庫(kù)”器官的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中受到誘導(dǎo)表達(dá)，而且在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)，隨著 StAAP1 表達(dá)量的下降，氨基酸的含量下降至少 50%,．同時(shí)，生物信息學(xué)分析表明，馬鈴薯氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 StAAP1與擬南芥氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 AtAAP6同源性最高[13].基于以上研究，筆者選用 AtAAP6為目標(biāo)基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將 AtAAP6基因成功導(dǎo)入馬鈴薯植株中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，成功獲得了轉(zhuǎn) AtAAP6基因的馬鈴薯陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株．利用RT-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AtAAP6 基因在各個(gè)株系都有表達(dá)，說(shuō)明AtAAP6 基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中進(jìn)行了正常的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但是不同株系表達(dá)量不同，這也為AtAAP6 基因表達(dá)水平對(duì)植株中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響提供了研究基礎(chǔ)．

馬鈴薯微型薯具有體積小、重量輕、生產(chǎn)不受季節(jié)限制、易儲(chǔ)藏、誘導(dǎo)周期短、繁殖速度高于常規(guī)田間生產(chǎn)、栽培成活率高等突出優(yōu)點(diǎn)，常用于優(yōu)良種質(zhì)的保存，微型薯還在當(dāng)今馬鈴薯基因工程研究中作為基因轉(zhuǎn)移的受體，另外，它也被用來(lái)進(jìn)行快速繁殖，作為種薯生產(chǎn)的一部分[23]．所以筆者利用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)誘導(dǎo)得到轉(zhuǎn)AtAAP6 基因的馬鈴薯微型薯，為馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化，提高馬鈴薯塊莖中的氨基酸以及貯藏蛋白含量，進(jìn)一步研究AtAAP6轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物氨基酸代謝調(diào)控中的功能提供了研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為更快更好地選育出優(yōu)質(zhì)馬鈴薯新品種，進(jìn)行高蛋白作物新種質(zhì)的創(chuàng)制提供了遺傳資源．

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還有其他一些重要的功能．比如，有一些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被認(rèn)為在病原體(特別是線蟲(chóng))取食活的植物組織時(shí)扮演著重要的角色．研究表明，AtAAP3 基因和 AtAAP6 基因突變體植株能維持根結(jié)線蟲(chóng)生長(zhǎng)率低于野生型[24]．這表明 AtAAP6基因在植物抵御病原體侵害方面也扮演著重要的角色．線蟲(chóng)等病原體對(duì)馬鈴薯根莖危害極大，并可以脫離寄主在土壤中長(zhǎng)期存留，致使防治難度大大增加，通過(guò)在馬鈴薯中過(guò)表達(dá)AtAAP6 基因，不僅可以更深入地研究 AtAAP6 基因在植物抵御外界病原體過(guò)程中的分子機(jī)制，而且為選育抗病馬鈴薯新品種提供了研究基礎(chǔ)．隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在植物中將會(huì)分離、克隆得到更多的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并逐漸研究解析它們?cè)谥参矬w內(nèi)的生物學(xué)功能，以應(yīng)用于糧食作物的遺傳改良工作中．

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究從擬南芥中成功克隆了 AtAAP6基因，并構(gòu)建 AtAAP6基因的植物表達(dá)載體，命名為pCAMBIA2300-AtAAP6，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將 AtAAP6基因?qū)腭R鈴薯植株中，成功得到了過(guò)表達(dá) AtAAP6基因的馬鈴薯植株及馬鈴薯微型薯，為深入闡明擬南芥氨基酸透性酶基因(AtAAP6)的功能提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步提高馬鈴薯塊莖中的氨基酸以及貯藏蛋白的含量等提供了研究基礎(chǔ).