胡黃連GPPS基因的生物信息學分析

鄭 雪，王慧娜，朱彥秋，丁衛(wèi)凱，李嬌嬌，周延清，段紅英

(河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

胡黃連(Picrorrhizaroyle) 別名假黃連，生于高山草地及礫石堆，分布海拔約為4 400 m。胡黃連是玄參科(Scrophulariaceae)胡黃連屬(Picrorrhizaroyle)植物的干燥根狀莖，可入藥，性寒、味苦。胡黃連作為印度和中國傳統(tǒng)的藥用植物，用藥歷史久遠，具有涼血止血、清熱利濕、解毒消疳的作用[1]，主要用于調(diào)治驚癇黃疸、濕熱瀉痢、痔瘺瘡瘍等癥[2-3]?，F(xiàn)代藥理學研究結(jié)果表明，胡黃連具有利膽保肝[4]、消炎抗菌[5-6]、保護神經(jīng)[7]、抗哮喘[8]、免疫活性[9]和降血糖[10]等多種藥理作用，臨床應用廣泛。胡黃連中主要的次生代謝產(chǎn)物是環(huán)烯醚萜苷等萜類物質(zhì)，其環(huán)烯醚萜苷類成分中的主要活性物質(zhì)是胡黃連苷[11]。很多研究表明，胡黃連苷已從胡黃連中被分離得到，為探究抗肝細胞毒性等生物活性成分提供了理論基礎(chǔ),也為中藥標準化提供了科學依據(jù)[12]。

胡黃連苷屬于萜類化合物，萜類化合物(Terpenoid)是一類次生代謝產(chǎn)物，普遍存在于高等植物中。目前，已知的萜類化合物已超過20 000種，高等植物中的萜類物質(zhì)是揮發(fā)油、香料、甾醇和萜類植保素的主要組成成分，有重要的藥用價值[13-19]。胡黃連苷中的環(huán)烯醚萜部分的合成依賴于前體物質(zhì)GPP(香葉基焦磷酸)，而GPP的C10骨架由 IPP(異戊烯基焦磷酸)及其異構(gòu)體 DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸)頭尾縮合而成，這一反應由GPPS(香葉基焦磷酸合酶)催化[20]。所以，GPPS在胡黃連苷的形成過程中有重要作用。

目前，已從多種植物中克隆得到GPPS基因。不同的高等植物中，GPPS蛋白的結(jié)構(gòu)域保守區(qū)均表現(xiàn)出很高的相似性[21-23]。雖然胡黃連化學成分方面的研究相對較多，并取得了顯著成果，但胡黃連萜類化合物合成的調(diào)控研究比較少。本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫里得到主產(chǎn)于印度的胡黃連GPPS基因的全長 cDNA 序列，利用生物信息學相關(guān)軟件對其序列特征、蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和功能進行分析，為揭示胡黃連中胡黃連苷等活性成分的調(diào)控機制和代謝途徑奠定基礎(chǔ)，也為進一步提高胡黃連中胡黃連苷等萜類化合物的含量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究利用的胡黃連GPPS基因數(shù)據(jù)來源于GenBank數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號為AY866498。

1.2 方法

1.2.1 胡黃連GPPS基因的序列分析 利用在線程序Blast和Blastp從核苷酸和氨基酸水平分析GPPS基因及其編碼氨基酸序列，利用DNAMAN對胡黃連GPPS蛋白序列與其他高等植物中的GPPS蛋白序列進行多序列比對分析，利用MEGA 6構(gòu)建各個物種的GPPS同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 胡黃連GPPS蛋白的理化性質(zhì)預測 利用DNAMAN對胡黃連GPPS蛋白相對分子質(zhì)量、等電點等進行分析，利用TMHMM在線分析胡黃連GPPS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，利用ExPASy SignalP 4.0 Serve分析胡黃連GPPS蛋白信號肽，利用WoLFPSORT在線定位預測胡黃連GPPS蛋白亞細胞結(jié)構(gòu)，利用ExPASy ProtScale分析胡黃連GPPS蛋白疏水性。

1.2.3 胡黃連GPPS蛋白的結(jié)構(gòu)預測及結(jié)構(gòu)域分析 利用SOPMA對胡黃連GPPS蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，采用Swiss-model同源建模方法對胡黃連GPPS蛋白進行在線3D結(jié)構(gòu)預測，利用NCBI的CDD(Conserved domain database)數(shù)據(jù)庫和Inter ProScan對胡黃連GPPS蛋白的結(jié)構(gòu)域進行在線分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡黃連GPPS基因序列分析

分析結(jié)果表明，胡黃連GPPScDNA全長1 381 bp，開放閱讀框(ORF)在基因序列上的區(qū)域為第114—1 229個核苷酸，開放閱讀框全長1 116 bp，編碼371個氨基酸(圖1)，相對分子質(zhì)量為40 384.1，等電點為5.28。氨基酸種類組成中(圖2)亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)的含量最多；而組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)以及色氨酸(Trp)的含量則相對較少。

由表1可知，經(jīng)比對分析獲得序列相似度較高的20條不同物種中的氨基酸序列。其中，胡黃連GPPS氨基酸序列與小花茉莉GPPS氨基酸序列相似性高達77%。利用DNAMAN軟件將胡黃連GPPS氨基酸序列與其中相似性較高的9條GPPS氨基酸序列進行多序列比對，結(jié)果表明，胡黃連中的GPPS蛋白和其他物種中GPPS蛋白在保守區(qū)結(jié)構(gòu)域上相似度很高(圖3)。

系統(tǒng)進化分析(圖4)表明，20個物種中的GPPS氨基酸序列聚合成2個分支：茶樹、三七、胡楊、歐榛、啤酒花、金絲小棗、紫花苜蓿形成一個分支，其與胡黃連GPPS親緣關(guān)系較遠；胡黃連、米團花、野甘草、芝麻、金魚草、小花茉莉、長春花、中?？Х?、北野菊、案頭菊、牽?；ā⒏适硇纬闪硗庖粋€分支。其中，胡黃連和金魚草、小花茉莉等親緣關(guān)系相對較近，植物形態(tài)學分類結(jié)果表明，其同為玄參科植物，系統(tǒng)進化分析結(jié)果與形態(tài)學植物分類結(jié)果相似。

圖1 胡黃連GPPS的cDNA序列及預測的編碼蛋白的氨基酸序列

圖2 胡黃連GPPS蛋白的氨基酸組成

表1 胡黃連GPPS氨基酸序列與NCBI中已知植物GPPS序列比對結(jié)果%

圖3 胡黃連GPPS與近緣物種GPPS蛋白的多序列比對

圖4 胡黃連近緣物種的GPPS系統(tǒng)進化分析結(jié)果

2.2 胡黃連GPPS 蛋白理化性質(zhì)分析

蛋白疏水性分析結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白屬于親水蛋白(圖5)。胡黃連GPPS蛋白的跨膜區(qū)域在線預測結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白不存在跨膜區(qū)，屬于膜外在蛋白(圖6)。

圖5 胡黃連GPPS蛋白疏水性預測結(jié)果

圖6 胡黃連GPPS蛋白跨膜區(qū)預測結(jié)果

胡黃連GPPS蛋白信號肽分析未發(fā)現(xiàn)信號肽，所以胡黃連GPPS蛋白為非分泌蛋白(圖7)；胡黃連GPPS蛋白亞細胞結(jié)構(gòu)定位結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白定位于葉綠體的可能性最高，定位系數(shù)為6。

圖7 胡黃連GPPS蛋白信號肽預測結(jié)果

2.3 胡黃連GPPS蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預測

二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白主要由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲構(gòu)成(圖8)，其中α螺旋和無規(guī)卷曲的比例較高，分別為47.71%和29.92%，延伸鏈占13.21%，β轉(zhuǎn)角占9.16%。

三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)卷曲構(gòu)成，其次是無規(guī)卷曲，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角所占比例很少(圖9)。胡黃連GPPS蛋白三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致，推測胡黃連GPPS蛋白為α螺旋型蛋白。

圖8 胡黃連GPPS二級結(jié)構(gòu)預測

圖9 胡黃連GPPS蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

2.4 胡黃連GPPS蛋白結(jié)構(gòu)域預測

胡黃連GPPS蛋白結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，其保守結(jié)構(gòu)域主要為聚丙烯合成酶結(jié)構(gòu)域(Polyprenyl synthetase)(IPR000092)，位于107—341位(PF00348)；萜類合成酶結(jié)構(gòu)域(Isoprenoid synthase domain)(IPR008949)，分別位于80—352位(SSF48576)和77—369位(1.10.600.10)；聚丙烯相關(guān)合成酶結(jié)構(gòu)域(Polyprenyl synthetase conserved site)(IPR033749)，分別位于156—172位(PS00723)和289—301位(PS00444)；另外，還有GPPS結(jié)構(gòu)域，在 IPR 中沒有明確分類，位于1—371位(PTHR43281)(圖10)。檢索 NCBI 的 CDD數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，胡黃連GPPS蛋白為類異戊二烯合酶超家族成員(圖11)，其功能與萜類物質(zhì)的合成十分密切。

圖10 Inter ProScan預測的胡黃連GPPS蛋白保守結(jié)構(gòu)域

圖11 CDD預測胡黃連GPPS蛋白結(jié)構(gòu)域

3 結(jié)論與討論

胡黃連苷是中藥胡黃連中的主要藥用成分，通過對胡黃連苷生物合成途徑的研究發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷萜類成分的生物合成屬MEP途徑，其中IPP和DMAPP 2種異構(gòu)體頭尾縮合結(jié)合為GPP，是 MEP 途徑的重要步驟，催化該反應進行的就是GPPS。隨著Burke等[24]第一次得到了GPPS基因全長cDNA序列后，相繼從擬南芥[25]、金魚草[26]等植物中也克隆得到了GPPS基因。截至目前，僅在少數(shù)植物中對GPPS的活性進行了研究，且在產(chǎn)生大量單萜的組織中才存在GPPS蛋白，因此純化比較困難[27]，對GPPS的研究主要集中在其對單萜和倍半萜的影響，如Rai等[28]從長春花中克隆到CrGPPS基因，發(fā)現(xiàn)CrGPPS蛋白質(zhì)在長春花中以雜聚肽和同聚肽2種形式存在，且發(fā)現(xiàn)只有含有GrGPPS.SSU的雜聚肽GPPS能調(diào)控單萜吲哚生物堿生物合成中的 GPP 流；Chang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，辣薄荷中的MpGPPS包含2個具有催化功能的大亞基和2個非催化的具有調(diào)控功能的小亞基，并且證實與薄荷醇的生物合成有關(guān)。

胡黃連GPPS的cDNA全長1 381 bp，其編碼的蛋白序列含有371個氨基酸殘基；亞細胞定位在葉綠體中發(fā)揮其生物功能，疏水性分析表明，胡黃連GPPS為親水性蛋白，在氨基酸序列中具有2個較強的親水區(qū)域，不含有信號肽序列，表明胡黃連GPPS為非分泌蛋白，這與薄荷GPPS基因、滇龍膽GPPS基因的研究結(jié)果一致[22-23]。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，胡黃連與小花茉莉、金魚草的親緣關(guān)系比較近，分別為77%和74%。此外，本研究也表明，GPPS基因在不同物種中無論cDNA序列長度、編碼的氨基酸殘基數(shù)還是保守結(jié)構(gòu)域都有較大的相似性。GPPS基因的保守結(jié)構(gòu)域主要是由聚丙烯合酶結(jié)構(gòu)域、萜烯合成酶結(jié)構(gòu)域和GPPS結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。使用DNAMAN軟件，將胡黃連與其他高等植物中的GPPS氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，GPPS氨基酸序列在不同物種中存在多個相似的保守結(jié)構(gòu)域，與前人對其他物種GPPS的序列分析結(jié)果相似[22-23]，進一步證明了胡黃連GPPS蛋白為異戊二烯合酶超家族成員。采用生物技術(shù)來緩解資源短缺等問題是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的目的之一，本研究將為從分子水平揭示胡黃連中胡黃連苷等活性成分的調(diào)控機制和代謝途徑奠定基礎(chǔ)，為發(fā)現(xiàn)新的萜類合成途徑和深入研究植物萜類合成途徑各組分功能提供了參考，也為單萜化合物的生物工程提供了候選基因。