黃瓜氮素脅迫相關(guān)基因CsAHP1的克隆及功能分析

杜亞琳，陳海燕，徐麗琳，王 琛，范蓮雪

(1.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002)

氮是植物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素之一。但過量施用化肥，特別是氮肥，是目前黃瓜等農(nóng)作物生產(chǎn)過程中面臨的主要問題。據(jù)報(bào)道，化肥中所包含的氮只有30%～50%被植物吸收和利用[1-3]。黃瓜是一種富含硝酸鹽的蔬菜。近年來，黃瓜栽培過程中氮肥的過量施用已經(jīng)導(dǎo)致環(huán)境嚴(yán)重污染[4]，并且也抑制了黃瓜植株的生長發(fā)育[5]。此外，蔬菜硝酸鹽污染是我國綠色蔬菜以及無公害蔬菜生產(chǎn)中面臨的主要問題，而過量施用氮肥不僅是造成該問題的主要原因之一[6-9]，還影響了農(nóng)民的收入。因此，培育耐氮素脅迫能力強(qiáng)的黃瓜新品種對減輕環(huán)境受損及降低黃瓜生產(chǎn)成本意義重大。

細(xì)胞分裂素是參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程的重要激素之一[10-13]，而含有組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)移蛋白(AHPs)是細(xì)胞分裂素信號級聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分，擬南芥中共有6種AHP蛋白[14]。然而在低氮脅迫條件下AHPs在黃瓜中的作用尚不清楚。

為深入了解黃瓜生殖生長過程中的氮循環(huán)與其耐氮素脅迫能力之間的關(guān)系，前期對黃瓜生殖生長期葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，獲得了1個(gè)黃瓜氮素脅迫相關(guān)候選基因CsAHP1(Csa1M572420)[15]。本研究對CsAHP1在不同氮素處理?xiàng)l件下的表達(dá)及其序列進(jìn)行了分析，構(gòu)建了35S∶∶CsAHP1擬南芥過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，并對轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐氮素脅迫能力進(jìn)行了分析，為深入理解CsAHP1基因參與黃瓜耐氮素脅迫的生理與分子機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料種植及氮素處理

本研究以黃瓜津研四號為試驗(yàn)材料，對其進(jìn)行低濃度氮素處理試驗(yàn)。將黃瓜津研四號種子先進(jìn)行催芽，然后移植于裝有蛭石的營養(yǎng)缽中，分別用3 mmol/L和14 mmol/L 的KNO3溶液進(jìn)行處理，處理后37 d對幼苗進(jìn)行全株取樣。

1.2 qRT-PCR分析

表1 基因克隆、表達(dá)分析和載體構(gòu)建所需引物序列

注：下劃線表示酶切位點(diǎn)。

1.3 CsAHP1基因的克隆及序列分析

在葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi)中搜索CsAHP1基因ID號 Csa1M572420.1，獲得其CDS序列信息，以該CDS序列為模板，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)克隆引物(表1)，并由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用PCR方法進(jìn)行CsAHP1基因的克隆。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線Blast工具和DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行序列比對和分析，利用MEGA 6.0軟件的鄰近法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。通過在線軟件Expasy對該基因所編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析。

1.4 CsAHP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的獲得

將CsAHP1基因的全長編碼序列克隆到帶有XbaⅠ/BamHⅠ酶切位點(diǎn)的pBI121載體中，然后將所構(gòu)建好的重組體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，最后通過花序侵染法[18]轉(zhuǎn)化到Col-0植株中。在含有卡那霉素(Kan)的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化的種子(T1)，并最終獲得純合的T3代種子，即35S∶∶CsAHP1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。

1.5 擬南芥植株根長和質(zhì)量的測定

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜耐氮素脅迫基因CsAHP1的表達(dá)分析

本研究前期通過Solexa測序技術(shù)對黃瓜耐氮素脅迫相關(guān)基因的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，鑒定出1個(gè)在低氮素脅迫條件下上調(diào)表達(dá)的基因CsAHP1[15]。為進(jìn)一步驗(yàn)證CsAHP1與耐氮素脅迫之間的關(guān)系，對CsAHP1的表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果表明，在低氮素脅迫條件下，CsAHP1基因表達(dá)水平顯著增加，這一結(jié)果與前期Solexa測序結(jié)果[15]一致(圖1)，表明CsAHP1為一個(gè)黃瓜低氮素脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因。

2.2 黃瓜CsAHP1基因的克隆及序列分析

黃瓜CsAHP1基因cDNA長462 bp，編碼153個(gè)氨基酸。在線軟件Expasy-ProtParam預(yù)測結(jié)果表明，CsAHP1蛋白分子質(zhì)量為17.78 ku，理論等電點(diǎn)為5.76。NCBI數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果顯示，CsAHP1屬于HPT家族。序列分析表明，CsAHP1的氨基酸序列與甜瓜的同源性為95%，與巨桉和川桑的同源性為64%，與擬南芥、煙草和番茄也均有> 60%的同源性，表明CsAHP1基因在不同物種中高度保守(圖2)。此外，在CsAHP1的同源序列中發(fā)現(xiàn)了HPT家族的典型特征，即組氨酸殘基(圖2)。

不同字母表示在0.05水平差異顯著，下同圖1 CsAHP1在不同氮素處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平

為了解黃瓜CsAHP1和其他物種AHP蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 6.0進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果表明，黃瓜CsAHP1和甜瓜關(guān)系最近(圖3)。

2.3 過表達(dá)CsAHP1基因擬南芥耐氮素脅迫能力分析

為進(jìn)一步闡明CsAHP1參與耐低濃度氮素脅迫過程的生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建了CsAHP1基因過量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入了擬南芥植株，獲得了1個(gè)35S∶∶CsAHP1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。根長測定結(jié)果表明，在低濃度氮素和高濃度氮素生長條件下，轉(zhuǎn)基因植株根長均顯著大于Col-0植株(圖4A、B)。在低濃度氮素條件下，Col-0植株的根長為1.34 cm，不到轉(zhuǎn)基因植株幼苗根長的44.7%(圖4B)。在高濃度氮素和低濃度氮素脅迫情況下，通過比較分析Col-0相對于轉(zhuǎn)基因株系在根長方面的變化程度發(fā)現(xiàn)，Col-0植株的根伸長發(fā)育受抑制程度(56.2%)顯著大于轉(zhuǎn)基因植株(36.7%)(圖4C)。

圖3 CsAHP1蛋白及其同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

A：在高氮和低氮條件下生長10 d的擬南芥Col-0植株和35S∶∶CsAHP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；B：Col-0植株和轉(zhuǎn)基因植株根長統(tǒng)計(jì)；C：低氮下Col-0植株和轉(zhuǎn)基因植株根長的減少比例圖4 不同氮素條件下的擬南芥植株

在低濃度氮素和高濃度氮素情況下，Col-0植株的質(zhì)量分別為1.34 mg和16.53 mg；而轉(zhuǎn)基因植株幼苗的質(zhì)量分別為4.37 mg和19.83 mg(圖5A)。相對于高濃度氮素條件下植株的質(zhì)量，在低氮素濃度脅迫條件下Col-0植株質(zhì)量下降程度(91.89%)顯著大于轉(zhuǎn)基因植株(77.96%)(圖5B)。綜上所述，CsAHP1的過表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐氮素脅迫能力。

圖5不同氮素條件下擬南芥Col-0植株和35S∶∶CsAHP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株質(zhì)量比較

3 結(jié)論與討論

本研究在高濃度氮素及低濃度氮素脅迫條件下對擬南芥Col-0植株和35S∶∶CsAHP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系根長及質(zhì)量的測定分析結(jié)果表明，35S∶∶CsAHP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株具有比Col-0植株更強(qiáng)的耐低濃度氮素脅迫能力。在本研究中，對這些結(jié)果給出了幾種可能的解釋。其中一個(gè)假設(shè)是CsAHP1可能通過細(xì)胞分裂素信號通路參與耐低濃度氮素脅迫過程。細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[19-24]，而AHP蛋白在細(xì)胞分裂素信號通路中起重要作用[25]。Yokoyama等[26]證明了CsAHP1的下游基因ARR10和ARR12參與擬南芥根的分化和伸長過程，而該過程受細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)。CsAHP1基因過表達(dá)可以使ARR10和ARR12出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，從而可能促進(jìn)了細(xì)胞分裂素的合成以維持?jǐn)M南芥植株的正常生長。有研究發(fā)現(xiàn)，外源細(xì)胞分裂素處理可緩解車前草因低濃度氮素脅迫所引起的生長抑制問題[27]。大多數(shù)在植株莖間中表達(dá)的AtNRTs都受細(xì)胞分裂素處理誘導(dǎo)表達(dá)，由此促進(jìn)硝酸鹽的運(yùn)輸和分布[28]。此外，低濃度氮素脅迫條件下擬南芥幼苗根部生長素含量極高[26]。細(xì)胞分裂素通過調(diào)節(jié)生長素的外排量來調(diào)節(jié)生長素的分布[29]，生長素-細(xì)胞分裂素相互作用控制根分生組織的發(fā)育[30-31]。因此，CsAHP1還可能通過促進(jìn)細(xì)胞分裂素合成，調(diào)節(jié)生長素分布以提高根分生組織活力，進(jìn)而增強(qiáng)其耐低濃度氮素脅迫能力。