丁草胺對(duì)金魚(yú)主要器官酯酶和過(guò)氧化物酶同工酶的影響

張曉紅，高晉華，范軒坤，陳婉珊，李瑞梅

（太原師范學(xué)院生物系，山西 太 原 030031）

丁草胺又稱(chēng)去草胺、馬歇特、滅草特，可抑制和破壞禾本科雜草幼根蛋白質(zhì)的合成而除草，應(yīng)用廣泛，現(xiàn)已成為中國(guó)三大除草劑之一[1]，2015年丁草胺使用量約占除草劑用量的50%～60%[2]。除草劑隨雨水沖刷最終釋放到水環(huán)境，美國(guó)明尼蘇達(dá)州地表水中發(fā)現(xiàn)乙草胺殘留濃度為1.2～2.5 μg/L[3]，菲律賓湖泊和河流中丁草胺殘留濃度達(dá)1.9～5.1 ng/L、地表水中達(dá)0.163 ng/L，而中國(guó)稻田水中達(dá)0.56～1.07 mg/L[4]，在一些工業(yè)區(qū)的土壤中含量超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)數(shù)倍[5]。環(huán)境中殘留的丁草胺會(huì)對(duì)水生生物造成危害。組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)丁草胺對(duì)魚(yú)類(lèi)有較高毒性，使魚(yú)鰓、肝胰臟和腎臟細(xì)胞水腫甚至中度壞死[6]， 染色體發(fā)生畸變[7]，影響斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育、生殖能力及性激素和甲狀腺激素的產(chǎn)生[8-9]等。

酯酶(esterase，EST)同工酶在酯代謝和生物膜的結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮作用，能催化酯鍵水解，屬于水解酶類(lèi)[10]，具有解毒作用，可水解大量外源酯類(lèi)化合物。過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)同工酶能利用H2O2氧化供氫體，反映生物體產(chǎn)生和消除自由基的能力[11]及體內(nèi)代謝狀況，對(duì)逆境反應(yīng)敏感，具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的雙重作用。研究表明除草劑百草枯、2，4-D丁酯、丁草胺均對(duì)金魚(yú)血清酯酶、過(guò)氧化物酶同工酶具有一定影響[12-13]，而對(duì)金魚(yú)組織器官同工酶影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文通過(guò)檢測(cè)市售60%丁草胺乳油對(duì)金魚(yú)(Carassius auratus)主要器官EST、POD同工酶的影響，探討丁草胺的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，為丁草胺對(duì)人類(lèi)健康影響的研究提供基礎(chǔ)依據(jù)，為農(nóng)田、水域丁草胺使用量、殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象和受試物

金魚(yú)體質(zhì)量(4.5±0.5) g，體長(zhǎng)(5.5±0.5) cm，購(gòu)于太原市花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)。丁草胺乳油(有效成分含量60%)購(gòu)自太原市順登農(nóng)業(yè)科技發(fā)展公司。丁草胺，CAS23184-66-9，分子式C17H26ClN O2，熔點(diǎn)＜-5 ℃，沸點(diǎn)156 ℃，相對(duì)密度1.06～1.07(25 ℃)，分解溫度165℃，閃點(diǎn)100 ℃。原藥純品為100 μg/mL淡黃色油狀液體，能溶于丙酮、乙醇、甲醇、苯等多種有機(jī)溶劑，在水中溶解度為2 mg/L?？构庑粤己茫?75 ℃開(kāi)始熱分解，pH值4以下不穩(wěn)定。商業(yè)劑型為60%乳油或5%顆粒劑。

1.2 急性染毒

丁草胺(60%乳液)對(duì)金魚(yú)染毒24 h的半數(shù)致死濃度(lethal concentration 50，LC)為1.31 mL/L[12]，據(jù)此配制

50 0.4、0.8、1.2 mL/L濃度組，設(shè)0.9%生理鹽水為對(duì)照組，每組選取金魚(yú)5尾，按0.1 mL/g的劑量腹腔注射，24 h后進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)期間不投餌。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 酶活性測(cè)定

染毒24 h后，立即將金魚(yú)取出，紗布擦干，斷尾，血止后，冰上取心臟、肝胰臟、鰓、腎臟，并立即置于含有生理鹽水的平底試管中(每條魚(yú)的相同組織取量相當(dāng))，冰上搗碎，高速冷凍勻漿機(jī)勻漿，取上清，分裝于離心管中，1 500 r/min冷凍(4 ℃)離心20 min，取上清，按2∶1的比例(V/V)加入40%甘油和0.1%溴酚藍(lán)指示劑。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)酶活性。POD同工酶用聯(lián)苯胺染色，EST同工酶參照Shaw和Prasad[13]的方法染色，拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Gel-Pro analyzer凝膠圖像分析軟件計(jì)算酶帶積分光密度(integrated optical density，IOD)值，分析遷移率(migration rate，Rf)。Rf=樣品移動(dòng)的距離/溴酚藍(lán)移動(dòng)的距離。以SPSS 18.0軟件，采用One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan Multiple Range test進(jìn)行校正。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 丁草胺對(duì)金魚(yú)心臟、肝胰臟、鰓、腎臟EST同工酶的影響

對(duì)照組與丁草胺0.4 mL/L組金魚(yú)心臟EST同工酶不表達(dá)(圖1A、表1)，濃度為0.8 mL/L時(shí)出現(xiàn)Rf 0.200(遷移率為0.200)的新條帶，活性IOD值為7.0(圖1C)；濃度為1.2 mL/L時(shí)活性增加了3倍，達(dá)20.8，且各濃度組間差異顯著(P＜0.05)，同時(shí)增加Rf 0.275和Rf 0.487的2條新條帶，活性分別為13.8和22.4，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)， 0.8 mL/L與 1.2 mL/L濃 度 組 間 差 異 顯 著(P＜0.05)。

金魚(yú)肝胰臟EST同工酶在對(duì)照組有Rf 0.237、0.325和0.563共3條條帶，活性均較強(qiáng)，IOD值分別為76.5、 60.2、 96.7(圖 1B、 1D)。 隨 丁 草 胺 濃 度 增 加(0.4、 0.8、 1.2 mL/L)， 3條 條 帶 活 性 分 別 由 46.5、29.2、69.9減弱到9.8、8.9、31.1，兩者呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r值和P值分別為r=-0.992，P=0.008；r=-0.955，P=0.045；r=-0.984，P=0.016)，各濃度組與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各濃度組間條帶差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

對(duì)照組金魚(yú)鰓EST同工酶有Rf 0.429條帶，活性微弱，IOD值為12.0(圖1C、1G)，丁草胺0.4 mL/L時(shí)活性升高為20.2，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，0.8 mL/L時(shí)活性消失，1.2 mL/L時(shí)活性恢復(fù)至對(duì)照水平，各濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

對(duì)照組金魚(yú)腎臟EST同工酶有Rf 0.438條帶，極微弱表達(dá)，IOD值為10.7(圖1D、1H)，丁草胺0.4 mL/L時(shí)活性升高為27.9，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)；0.8和1.2 mL/L時(shí)活性消失，且與0.4 mL/L間差異顯著(P＜0.05)。

表1 丁草胺染毒后金魚(yú)EST同工酶的IOD(-x±s，n=3)

2.2 丁草胺對(duì)金魚(yú)心臟、肝胰臟、鰓、腎臟POD同工酶的影響

對(duì)照組和丁草胺0.4 mL/L、0.8 mL/L時(shí)，金魚(yú)心臟POD同工酶不表達(dá)(圖2A，表2)。1.2 mL/L時(shí)出現(xiàn)Rf 0.113新條帶，IOD值為50.3，活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，與0.4和0.8 mL/L濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

對(duì)照組金魚(yú)肝胰臟POD同工酶Rf 0.100條帶IOD值為53.2(圖2B、2D)，隨丁草胺濃度增加，活性先升高后降低(72.0、83.9、25.2)，0.8和1.2 mL/L濃度組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)。各濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

圖2 丁草胺對(duì)金魚(yú)POD同工酶活性的影響

表2 丁草胺染毒后金魚(yú)POD同工酶的IOD(-x±s，n=3)

對(duì)照組金魚(yú)鰓POD同工酶Rf 0.185條帶IOD值為39.9(圖2C、2G)，丁草胺0.4 mL/L時(shí)活性升高為55.5，0.8 mL/L時(shí)消失，1.2 mL/L時(shí)活性急劇升高為65.3，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，0.8 mL/L與其他濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

對(duì)照組金魚(yú)腎臟POD同工酶Rf 0.343活性較強(qiáng)(IOD值73.9)(圖2D、2H)，丁草胺0.4和0.8 mL/L時(shí)活性消失，1.2 mL/L時(shí)IOD值為57.6，顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。1.2 mL/L與其他濃度組間差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

丁草胺低濃度(0.4 mL/L)時(shí)，供應(yīng)心腦的血液中外源丁草胺，經(jīng)肝胰臟、血清[12]、鰓、腎臟EST同工酶的應(yīng)急解毒后已極微量，因而心臟EST同工酶與對(duì)照組均無(wú)表達(dá)，丁草胺中濃度(0.8 mL/L)時(shí)金魚(yú)心臟EST同工酶出現(xiàn)1條新條帶，活性是對(duì)照組的7倍，而在接近半數(shù)致死濃度(1.2 mL/L)時(shí)EST同工酶表型復(fù)雜，活性極強(qiáng)，達(dá)到對(duì)照組的50多倍，說(shuō)明心臟在丁草胺中、高濃度時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，這與Xiang等[14]丁草胺對(duì)斑馬魚(yú)丙二醛(MDA)的毒性結(jié)果類(lèi)似。低濃度(0.4 mL/L)時(shí)鰓、腎臟EST同工酶活性分別升高2倍、3倍，說(shuō)明低濃度時(shí)丁草胺誘導(dǎo)鰓、腎臟EST同工酶活性，增強(qiáng)其解毒功能；肝胰臟EST同工酶具3條極強(qiáng)活性條帶，說(shuō)明肝胰臟EST同工酶在酯類(lèi)代謝中發(fā)揮著重要作用，隨丁草胺濃度增加肝胰臟EST同工酶活性逐漸降低，說(shuō)明丁草胺對(duì)金魚(yú)肝胰臟EST同工酶活性具有極強(qiáng)的抑制作用。丁草胺中濃度(0.8 mL/L)時(shí)血清、鰓、腎臟EST同工酶活性降低或消失，可能是丁草胺抑制其合成或破壞其結(jié)構(gòu)。高濃度(1.2 mL/L)時(shí)血液、鰓、腎臟及心臟EST同工酶活性急劇增強(qiáng)，可能是EST同工酶失去保護(hù)血細(xì)胞、鰓、腎臟及心臟細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能，細(xì)胞膜通透性改變，而使胞內(nèi)被誘導(dǎo)的EST同工酶迅急大量釋放，以增強(qiáng)應(yīng)急解毒功能，研究表明單?；视王ッ?MAGL)作為水解酶，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲、存活以及在體內(nèi)生長(zhǎng)[15]，丁草胺對(duì)酯酶家族成員的作用還有待進(jìn)一步研究。

丁草胺高濃度(1.2 mL/L)時(shí)金魚(yú)心臟POD同工酶出現(xiàn)1條新條帶，酶活性是對(duì)照組的50倍，說(shuō)明高濃度時(shí)金魚(yú)心臟POD同工酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)抗氧化防御極強(qiáng)[16]，對(duì)丁草胺反應(yīng)靈敏，結(jié)果與EST同工酶類(lèi)似。

對(duì)照組腎臟POD同工酶活性極強(qiáng)，說(shuō)明其在腎臟解毒過(guò)程中發(fā)揮重要作用。丁草胺低濃度(0.4 mL/L)時(shí)腎臟POD同工酶即消失，說(shuō)明丁草胺對(duì)腎臟POD同工酶抑制作用最強(qiáng)，鰓、肝胰臟POD同工酶活性增強(qiáng)，說(shuō)明鰓、肝胰臟對(duì)丁草胺的抗氧化能力強(qiáng)于腎臟、心臟。鰓、腎臟、肝胰臟POD同工酶活性變化與EST同工酶類(lèi)似。

隨丁草胺濃度增加鰓POD同工酶活性升高、消失后又增強(qiáng)，腎臟POD同工酶活性消失后活性較對(duì)照組下降、肝胰臟POD同工酶活性升高后降低，結(jié)果與丁草胺使斑馬魚(yú)活性氧(ROS)下降[14]，肝胰臟SOD、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)酶活性下降[16]一致，反映POD同工酶高度的組織特異性，不同物種不同抗氧化酶對(duì)外源丁草胺抗氧化存在差異。POD同工酶中的過(guò)氧化物酶1具有抗氧化作用[17]，且在肝癌形成和惡性進(jìn)展中發(fā)揮一定作用[18]，參與肝癌發(fā)生進(jìn)展調(diào)控，在肝癌轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)升高，與凋亡抑制，腫瘤存活率增加有關(guān)，丁草胺與癌細(xì)胞的發(fā)生是否存在一定關(guān)系，仍需深入研究。

綜上所述，丁草胺對(duì)金魚(yú)不同組織器官EST、POD同工酶影響不同。丁草胺抑制金魚(yú)肝胰臟EST、腎臟POD同工酶活性，中濃度(0.8 mL/L)及以上丁草胺破壞鰓、腎臟EST、POD同工酶活性。60%乳油型丁草胺主要由丁草胺原藥和其他成分混制而成。酶活性的變化，是丁草胺的單獨(dú)作用還是復(fù)雜成分之間的協(xié)同作用仍有待進(jìn)一步研究。