體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的研究與應(yīng)用進(jìn)展

王 丹 耿興超 李 波 王 雪 * 文海若*

( 1．中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，江蘇 南 京 211198；2．中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心，藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100176 )

癌癥是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的疾病。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)(American Cancer Society，ACS)[1]發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，2018年美國(guó)將出現(xiàn)新發(fā)癌癥病例超過173萬(wàn)例，癌癥死亡病例接近70萬(wàn)例。隨著人口增長(zhǎng)、老齡化加劇、以及不健康的生活方式等因素(如吸煙、運(yùn)動(dòng)量過少和不健康飲食等)，發(fā)展中國(guó)家癌癥的疾病負(fù)擔(dān)日益增加。在眾多癌癥誘因中，長(zhǎng)期接觸有害因素與癌癥的發(fā)生直接相關(guān)，其中約90%以上為化學(xué)因素。監(jiān)管部門和企業(yè)加強(qiáng)對(duì)致癌物的篩查并逐步禁止其生產(chǎn)和銷售，或制定出最低接觸安全劑量將有效降低整體癌癥的發(fā)生率。

用于評(píng)價(jià)新藥潛在致癌性風(fēng)險(xiǎn)的致癌試驗(yàn)是安全評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH)[2]、美國(guó)食品藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)[3]等國(guó)際機(jī)構(gòu)已頒布了有關(guān)新藥臨床前致癌性評(píng)價(jià)的技術(shù)指導(dǎo)原則或指南，對(duì)藥物致癌性試驗(yàn)的必要性、試驗(yàn)方法、劑量選擇和限度進(jìn)行了全面闡述。為期兩年的嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)在近半個(gè)世紀(jì)以來一直作為臨床前藥物致癌性評(píng)價(jià)的金標(biāo)準(zhǔn)，其試驗(yàn)結(jié)果幾乎可以辨別所有已知的人類致癌物。然而該方法也存在一定弊端。據(jù)統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)每種化學(xué)物質(zhì)需要兩個(gè)物種的動(dòng)物共計(jì)600～800只，加上超過40種組織的病理學(xué)檢查，需要花費(fèi)大概100萬(wàn)歐元[4]。長(zhǎng)期動(dòng)物試驗(yàn)并不適用于例如歐盟法規(guī)《化學(xué)品的注冊(cè)、評(píng)估、授權(quán)和限制》(Registration，Evaluation，Authorization and Restriction of Chemicals，REACH)[5]要求下的大量化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)。此外，歐盟自2013年開始禁止使用動(dòng)物開展化妝品安全評(píng)價(jià)研究，并禁止出售任何經(jīng)過動(dòng)物試驗(yàn)的化妝品產(chǎn)品?？梢姡O(jiān)管單位迫切需要確立符合動(dòng)物試驗(yàn)3R原則的高通量替代試驗(yàn)方法。細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(cell transformation assays，CTAs)是從細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)水平上研究腫瘤發(fā)生與發(fā)展的基本技術(shù)，能夠較為快速檢測(cè)化學(xué)物的致癌作用，在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及防治方面具有重要意義。本文將就體外CTAs的背景、優(yōu)化、影響因素以及國(guó)內(nèi)外發(fā)展趨勢(shì)4個(gè)方面進(jìn)行綜述，為轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的應(yīng)用提供借鑒。

1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的背景

Berwald和Sachs[6]于1963年首次發(fā)現(xiàn)原代的正常敘利亞地鼠胚胎(Syria hamster embryo cell，SHE)細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間并移植回地鼠體內(nèi)后可致瘤。進(jìn)一步研究顯示，SHE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變與嚙齒類動(dòng)物致癌性之間有良好的相關(guān)性，從而逐漸形成了使用CTAs對(duì)化合物致癌性進(jìn)行研究的想法。SHE轉(zhuǎn)化試驗(yàn)一方面借助SHE細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的能力檢測(cè)致癌物，另一方面作為體外試驗(yàn)系統(tǒng)也可以研究致癌機(jī)制，包括腫瘤發(fā)生的多階段性，致癌物改變DNA 的原理以及在腫瘤形成過程中特定基因的突變等。然而不同試驗(yàn)室間操作變異性較大，且經(jīng)典的遺傳毒理試驗(yàn)也可以檢出大部分的致癌物，SHE轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的發(fā)展受到了限制。直至1996年，Kerckaert等[7]先后報(bào)道了培養(yǎng)基的pH值是決定SHE細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化能力的關(guān)鍵因素之一，并對(duì)該方法進(jìn)行了改良，形成我們今天所熟知的降低了pH值的SHE轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，從而提高了細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化與嚙齒類致癌性結(jié)果的一致性。

隨著試驗(yàn)方法的不斷優(yōu)化，使用SHE轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)行致癌性機(jī)制探討和驗(yàn)證的研究持續(xù)至今。以SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)為基礎(chǔ)，Aaronson和Todaro[8]率先建立了體外的小鼠細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。與地鼠胚胎細(xì)胞不同，小鼠胚胎細(xì)胞(其中BALB/c 3T3和C3H 10T1/2最為常見)更易于自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)橛郎?xì)胞，可以將轉(zhuǎn)化灶的形成作為致癌物誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的檢測(cè)終點(diǎn)。如Sasaki等[9]利用v-Ha-ras轉(zhuǎn)染BALB/c 3T3后得到的Bhas 42細(xì)胞系開展CTAs。此外，人源CTAs被認(rèn)為是檢測(cè)人類致癌物的最佳選擇，因受細(xì)胞來源限制，使用人類永生化細(xì)胞系開展轉(zhuǎn)化試驗(yàn)成為當(dāng)前主要的發(fā)展趨勢(shì)。

嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞或人類細(xì)胞的轉(zhuǎn)化均至少包含4個(gè)階段[10]：①細(xì)胞分化阻滯；②通過獲得無(wú)限壽命、非整倍體的核型以及遺傳的不穩(wěn)定性進(jìn)行永生性表達(dá)；③獲得致瘤性；④包括轉(zhuǎn)移在內(nèi)的完全惡性腫瘤。SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)采用的是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的第一階段作為誘導(dǎo)腫瘤形成前的終點(diǎn)，也就是細(xì)胞分化阻滯；而永生化BALB/c 3T3以及人類細(xì)胞則依據(jù)非致癌永生性到致癌性轉(zhuǎn)變形成灶以及典型的非貼壁依賴型生長(zhǎng)作為檢測(cè)終點(diǎn)。

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的優(yōu)化

2.1 SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是經(jīng)典的CTAs方法，自誕生以來經(jīng)歷了一系列的優(yōu)化和改良。SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中細(xì)胞接種密度較小，通常使用X射線照射刺激細(xì)胞的滋養(yǎng)層供養(yǎng)靶細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而細(xì)胞滋養(yǎng)層的背景為分辨轉(zhuǎn)化群落和正常群落造成一定困難。通過將靶細(xì)胞接種在培養(yǎng)過原種細(xì)胞的條件培養(yǎng)基里而不是滋養(yǎng)層細(xì)胞上[11]，這一改進(jìn)，可避免X射線的使用，細(xì)胞群落的分辨也變得更為容易。此外，Schechtman等[12]在BALB/c 3T3和C3H 10T1/2細(xì)胞系中增加大鼠肝S9活化體系，擴(kuò)大了可轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的敏感度。

如何客觀準(zhǔn)確地判斷轉(zhuǎn)化灶，是細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化需要攻克的一大難題。研究人員正在探索是否能使用紅外光譜分析細(xì)胞組分(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖原、DNA、RNA)，從而對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞群落進(jìn)行更為客觀的判定并提供機(jī)制方面的信息。例如，使SHE細(xì)胞在紅外反射的載玻片上生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化結(jié)果通過傅里葉變換衰減全反射紅外光譜和常規(guī)計(jì)數(shù)兩種方法觀察[13]，發(fā)現(xiàn)前者的計(jì)數(shù)結(jié)果大于常規(guī)計(jì)數(shù)，紅外可監(jiān)測(cè)到視覺無(wú)法辨認(rèn)的轉(zhuǎn)化灶。

從地鼠體內(nèi)分離得到的SHE細(xì)胞是多種胚胎細(xì)胞的混合物，其中只有一部分子群能發(fā)生形態(tài)學(xué)上的轉(zhuǎn)變。研究顯示這種易感性的群體包括間葉和上皮兩種細(xì)胞中未分化的和定向干細(xì)胞樣的部分，可通過阻礙這些細(xì)胞的分化而發(fā)生轉(zhuǎn)化。而癌細(xì)胞的來源可能也對(duì)應(yīng)于正常的組織干細(xì)胞和定向組細(xì)胞[14]。這也成為SHE試驗(yàn)與體內(nèi)試驗(yàn)有關(guān)聯(lián)性的重要證據(jù)。如果能應(yīng)用現(xiàn)代的分析手段描繪SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化中易感子群并確定干細(xì)胞與定向組細(xì)胞的潛在角色，將有助于促進(jìn)SHE試驗(yàn)的發(fā)展。

2.2 BALB/c 3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

BALB/c 3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)以轉(zhuǎn)化灶計(jì)數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，數(shù)據(jù)分析是試驗(yàn)的重要組成部分。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，通常采用每個(gè)平皿中三型轉(zhuǎn)化灶的數(shù)目作為試驗(yàn)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，然而BALB/c 3T3轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可用的草案里沒有強(qiáng)調(diào)必須用哪種方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所以有的人就每個(gè)平皿中轉(zhuǎn)化灶的數(shù)目進(jìn)行分析，如線性方差分析[15]，非參數(shù)曼-惠特尼U檢驗(yàn)或者泊松分布的參數(shù)檢驗(yàn)等；另一部分人則對(duì)每個(gè)平皿中轉(zhuǎn)化灶比例進(jìn)行分析，如確切概率法[16]。歐洲替代方法驗(yàn)證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)回顧了這些應(yīng)用于BALB/c 3T3細(xì)胞試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析方法后，推薦了威廉姆型衰退保護(hù)趨勢(shì)測(cè)試的負(fù)二項(xiàng)廣義線性模型和通過特殊的轉(zhuǎn)換對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化兩種方法。Hoffmann等[17]對(duì)上述兩種方法進(jìn)行了驗(yàn)證，認(rèn)為它們適于分析BALB/c 3T3試驗(yàn)數(shù)據(jù)。Kajiwara等[18]則建議使用ITES培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，即在T培養(yǎng)基或者DMEM/F12培養(yǎng)基中加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺以及硒和2%的胎牛血清以增強(qiáng)轉(zhuǎn)化頻率，這種改進(jìn)同時(shí)也讓轉(zhuǎn)化灶的形成更為清晰并縮短了試驗(yàn)周期。該方法在日本多個(gè)試驗(yàn)室都得以復(fù)現(xiàn)，但由于測(cè)試的化合物較少，很難得出ITES培養(yǎng)基促進(jìn)BALB/c 3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化的結(jié)論。隨后Kajiwara等人又用更多的化合物進(jìn)行驗(yàn)證，證明該方法是可靠的短期檢測(cè)潛在致癌物的方法。

2.3 Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

在Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，與人類腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物也被認(rèn)為是評(píng)價(jià)細(xì)胞轉(zhuǎn)化較為客觀的方法。乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase， AChE)和 丁 酰 膽 堿 酯 酶(butyrylcholinesterase，BChE)在腫瘤細(xì)胞的增殖與分化過程中扮演著重要角色，其基因會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變或是其產(chǎn)物可在多種組織的腫瘤中異常表達(dá)。在體外研究中已證實(shí)AchE可以促進(jìn)非貼壁依賴型腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。肺、睪丸、輸卵管、胃腸道腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的異常表達(dá)。在Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，未轉(zhuǎn)化的Bhas 42細(xì)胞為單層，并且很少或幾乎不表達(dá)AchE、BChE和ALP，而三型轉(zhuǎn)化灶(轉(zhuǎn)化灶的特征為強(qiáng)嗜堿性，形態(tài)異于單層生長(zhǎng)的細(xì)胞，生長(zhǎng)密集，在轉(zhuǎn)化灶的邊緣細(xì)胞隨機(jī)定位)與二型轉(zhuǎn)化灶(生長(zhǎng)密集，復(fù)層生長(zhǎng)，嗜堿性弱于三型轉(zhuǎn)化灶)相比，AchE、BChE和ALP活性和表達(dá)量都更高[20]。這些生化指標(biāo)也可以用于BALB/c 3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，但并不適宜SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)腫瘤標(biāo)志物在胚胎細(xì)胞中活性也很好(SHE細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)與Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的比較見表1)。

Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)也進(jìn)行了高通量改良。從平皿到6孔板，以及目前使用的96孔板，將該方法的高通量篩選致癌物的能力逐步提升。Sasaki等[21]采用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，簡(jiǎn)化了轉(zhuǎn)化灶的計(jì)數(shù)，無(wú)論孔中有1個(gè)或是幾個(gè)轉(zhuǎn)化灶都記作1個(gè)，最終記錄每塊孔板上有轉(zhuǎn)化灶的孔數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)化灶的高通量篩選。王穎等[22]采用H22O來區(qū)分未轉(zhuǎn)化細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因低濃度的H2O2可以殺傷大部分正常細(xì)胞，而對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞影響較小，在對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行CCK-8染色后，可以采用酶標(biāo)儀等記錄數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，增加了結(jié)果的客觀性。Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中啟動(dòng)試驗(yàn)與促癌試驗(yàn)分別進(jìn)行，記種板日為第0天。啟動(dòng)試驗(yàn)在第1天給藥，然后在第4、7、10、14天更換新鮮培養(yǎng)基；促癌試驗(yàn)在第4、7、10天給藥，第14天更換新鮮培養(yǎng)基(以陽(yáng)性劑為例，試驗(yàn)流程圖詳見圖1和圖2)。

表1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的比較

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)流程-啟動(dòng)試驗(yàn)

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)流程-促癌試驗(yàn)

2.4 兩階段細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

Lasne等在1974年首次采用小鼠成纖維細(xì)胞系模擬兩階段的細(xì)胞形態(tài)惡性轉(zhuǎn)化，其后Sasaki等[23]在BALB/c 3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出了兩階段轉(zhuǎn)化試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。這種改進(jìn)根據(jù)腫瘤發(fā)生的多階段理論，從試驗(yàn)設(shè)計(jì)上將啟動(dòng)劑和促癌劑的檢測(cè)區(qū)分為兩階段，同時(shí)檢測(cè)遺傳毒性致癌物與非遺傳毒性致癌物的活性。Sasaki等[24]經(jīng)過長(zhǎng)期試驗(yàn)對(duì)這種方法進(jìn)行了改進(jìn)，最終推薦使用以BALB/c 3T3(clone A31-1-1)為基礎(chǔ)的兩階段細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)化方法。Bhas 42細(xì)胞中導(dǎo)入了癌基因，因此可視為已處于啟動(dòng)階段，在檢測(cè)促癌物時(shí)可以不必經(jīng)過啟動(dòng)劑預(yù)處理便可檢測(cè)促癌活性，縮短了試驗(yàn)周期。由于細(xì)胞分裂在腫瘤啟動(dòng)階段起著很重要的作用，而在腫瘤促長(zhǎng)階段細(xì)胞間通訊則占有重要地位。因此可以通過接種不同濃度的細(xì)胞，調(diào)整待測(cè)物質(zhì)與細(xì)胞共同培養(yǎng)的時(shí)間，采用不同的培養(yǎng)間隔可區(qū)分啟動(dòng)劑和促癌劑。兩階段細(xì)胞轉(zhuǎn)化即是在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期給予啟動(dòng)劑進(jìn)行短暫處理，引起細(xì)胞基因突變而誘發(fā)轉(zhuǎn)化。而在細(xì)胞融合后的生長(zhǎng)靜止期用促癌劑處理較長(zhǎng)的時(shí)間，阻斷細(xì)胞間通訊從而誘發(fā)轉(zhuǎn)化，這樣可以提高細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的頻率。然而，腫瘤啟動(dòng)階段被認(rèn)為是涉及一個(gè)或多個(gè)突變的不可逆的過程，采用Bhas 42細(xì)胞篩查啟動(dòng)劑時(shí)，啟動(dòng)劑仍能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化可能是引起其他轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的突變從而引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。ECVAM[25]于2013年指出，Bhas 42細(xì)胞高通量轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是一種體外致癌性的檢測(cè)方法，但該試驗(yàn)方法并不用于明確區(qū)分致癌物屬于遺傳毒性致癌物或非遺傳毒性致癌物。

2.5 人源細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

除了基于嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化模型，利用人源細(xì)胞通過在生理?xiàng)l件下促進(jìn)其轉(zhuǎn)化來鑒別致癌物方面也不失為一個(gè)理想模型。然而轉(zhuǎn)化人源細(xì)胞比嚙齒類需要更多的基因。例如，SV40大T抗原和癌等位基因H-RAS的引入足以讓嚙齒類細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化但卻一直無(wú)法誘導(dǎo)人類細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，這也是基于人源細(xì)胞的CTAs還沒有作為常規(guī)方法而建立起來的主要原因之一[4]。另外，復(fù)制性衰老是人類細(xì)胞永生化和發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的主要障礙，這個(gè)障礙也限制了人源CTAs的發(fā)展。嚙齒類動(dòng)物試驗(yàn)為繞過促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化的癌基因/應(yīng)激誘導(dǎo)衰老提供了有用的方式，但是依舊不能克服復(fù)制性衰老。而對(duì)克服復(fù)制性衰老所需基因的認(rèn)識(shí)正在增加，這將有助于模擬人類端粒酶活性和復(fù)制性衰老旁路試驗(yàn)的發(fā)展。

3 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響因素

適于開展轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的細(xì)胞需具備以下3個(gè)特點(diǎn)：在體外生長(zhǎng)過程中具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性，對(duì)致癌因子的作用反應(yīng)敏感，以及較低的細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化率。常用的細(xì)胞系包括：以SHE試驗(yàn)為主的原代正常雙倍體細(xì)胞和永生化的非整倍體小鼠細(xì)胞系(傳代細(xì)胞系，BALB/c 3T3和C3H 10T1/2和Bhas 42細(xì)胞系轉(zhuǎn)化試驗(yàn)最為常見)。原代細(xì)胞系容易制備和培養(yǎng)，自發(fā)轉(zhuǎn)化率低，轉(zhuǎn)化后容易識(shí)別并能以定量的方式獲得數(shù)字結(jié)果。與原代細(xì)胞相比，傳代細(xì)胞則具有細(xì)胞群落穩(wěn)定性高，試驗(yàn)重復(fù)性好，劑量反應(yīng)關(guān)系明顯等特點(diǎn)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)化可能受到其他因素的制約：①細(xì)胞性質(zhì)。細(xì)胞分化程度與轉(zhuǎn)化潛伏期長(zhǎng)短呈負(fù)相關(guān)，如妊娠12天的鼠胚細(xì)胞和20個(gè)月齡的金黃地鼠皮膚成纖維細(xì)胞誘發(fā)轉(zhuǎn)化的潛伏期分別為20.3和10.8個(gè)細(xì)胞群體倍增時(shí)間[26]。②培養(yǎng)條件。血清濃度降低，細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低；有滋養(yǎng)層細(xì)胞存在時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)化率提高；培養(yǎng)基的組成，ITES培養(yǎng)基能促進(jìn)BALB/c 3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；培養(yǎng)溫度降低、加入兩性霉素和長(zhǎng)期缺氧會(huì)使已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞失去轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)。③給藥方式與活化酶的使用。因細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)給藥周期較長(zhǎng)，而S9等體外活化酶系統(tǒng)本身存在一定細(xì)胞毒性不適于與該方法結(jié)合長(zhǎng)期重復(fù)給藥，可能無(wú)法檢出需代謝活化后產(chǎn)生致癌性物質(zhì)。然而，研究顯示Bhas 42細(xì)胞本身含有CYP1A1等P450細(xì)胞色素酶，可代謝多環(huán)芳烴、乙酰氨基芴和環(huán)磷酰胺等物質(zhì)[27]。

4 細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的發(fā)展趨勢(shì)

CTAs當(dāng)前已被廣泛應(yīng)用于化學(xué)物、農(nóng)藥、化妝品、環(huán)境污染物等[28-29]的檢測(cè)。當(dāng)其試驗(yàn)結(jié)果與遺傳毒性數(shù)據(jù)、構(gòu)效分析、藥代動(dòng)/毒代動(dòng)信息相結(jié)合時(shí)，可對(duì)化合物潛在致癌性進(jìn)行相對(duì)綜合的評(píng)估。目前CTAs的應(yīng)用前景包括：①解釋體外遺傳毒性結(jié)果；②評(píng)估在低預(yù)測(cè)性傳統(tǒng)遺傳毒性試驗(yàn)中化學(xué)物的分類，篩選遺傳毒性或非遺傳毒性致癌物；④考察腫瘤的啟動(dòng)和促進(jìn)行為；⑤研究特定致癌物的致癌機(jī)制等。

CTAs對(duì)于尚未實(shí)施致癌試驗(yàn)的化合物(如REACH法規(guī)下大范圍的檢測(cè)項(xiàng)目)或常規(guī)遺傳毒性試驗(yàn)方法不適用的化合物(如無(wú)法經(jīng)細(xì)菌代謝的醫(yī)用納米材料或抑菌性強(qiáng)的化合物，不適合開展Ames試驗(yàn))，尤其是化妝品和醫(yī)療器械的早期致癌性預(yù)測(cè)方面有重大意義。其最重大的價(jià)值是對(duì)非遺傳毒性致癌物進(jìn)行鑒別，并提供低劑量條件下化合物的遺傳毒性作用機(jī)制，以驗(yàn)證閾值下遺傳毒性化合物的特征。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)地鼠細(xì)胞可克服癌基因應(yīng)激/誘導(dǎo)衰老屏障的研究對(duì)CTAs試驗(yàn)的預(yù)測(cè)能力是有力的支持[4]。BALB/c 3T3和Bhas 42試驗(yàn)中轉(zhuǎn)換后生化指標(biāo)的鑒別也比傳統(tǒng)方法更具客觀性。然而很多科學(xué)家仍舊對(duì)CTAs持保留意見，該方法目前尚未被國(guó)際安全監(jiān)管體系完全接受。有待改進(jìn)的關(guān)鍵內(nèi)容是如何通過CTAs對(duì)致癌機(jī)制進(jìn)行探討以及如何增加計(jì)數(shù)的客觀性等。Sasaki等通過對(duì)Bhas 42 CTAs的試驗(yàn)操作方法和評(píng)價(jià)方法進(jìn)行規(guī)范化，已形成指導(dǎo)原則草案并遞交OECD[30]，有望在今后應(yīng)用于致癌性安全性評(píng)價(jià)。就目前應(yīng)用較多的Bhas 42細(xì)胞來說，限制該試驗(yàn)發(fā)展的主要問題是細(xì)胞活性，活性的強(qiáng)弱直接影響了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化力和最終轉(zhuǎn)化灶形成的多寡。當(dāng)前迫切需要改善其細(xì)胞活性的方法，在試驗(yàn)過程中務(wù)必對(duì)其活性進(jìn)行密切觀察。

5 結(jié)語(yǔ)

CTAs是應(yīng)用較為廣泛的潛在致癌物檢測(cè)方法。盡管該方法與嚙齒類生物試驗(yàn)存在良好的相關(guān)性，但并不能完全模擬體內(nèi)的整個(gè)致癌過程，而且考慮到用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞較為主觀以及對(duì)機(jī)制理解的缺乏，較難作為標(biāo)準(zhǔn)被接受。然而CTAs可以同時(shí)檢測(cè)遺傳毒性與非遺傳毒性致癌物，并確定化合物毒性的閾值。以Bhas 42細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)為例，它可用于化合物致癌性進(jìn)行早期的初步篩選，是對(duì)體內(nèi)多終點(diǎn)遺傳毒性評(píng)價(jià)結(jié)果的良好補(bǔ)充。隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，研究人員對(duì)機(jī)制的研究和了解不斷深入。通過不斷地對(duì)方法學(xué)優(yōu)化和改良，將會(huì)形成更為客觀準(zhǔn)確的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶判斷標(biāo)準(zhǔn)，CTAs將在臨床前致癌性早期評(píng)價(jià)的舞臺(tái)上發(fā)揮更重要的價(jià)值。