納米顆粒誘導(dǎo)肝臟毒性的研究進(jìn)展

王 晗倪 娟 周 滔 楊國防 汪 旭*

( 1．云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆 明 650500；2．云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆 明 650500；3．上海三譽(yù)華夏基因科技有限公司，上海 201100 )

納米顆粒(nanoparticles，NPs)，是指直徑小于100 nm的微粒。納米級的顆粒較正常顆粒(fine particle)而言，具有不同的理化特征，如表面積與體積比增大，活性位點、電荷和形狀改變，表面衍生性增加，光催化活性增強(qiáng)，熱性能更為優(yōu)越等。目前，NPs已廣泛運(yùn)用到電子工業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、建筑材料、紡織品、醫(yī)療器械和藥物、個人護(hù)理用品如防曬霜等領(lǐng)域[1]。隨著人類越來越多的暴露在含NPs的用品中，NPs對人的健康風(fēng)險評估已成為研究熱點[2]。研究已證實，NPs對人類健康存在威脅，納米氧化鋅、二氧化鈦、氧化銅、碳納米管、碳富勒烯等進(jìn)入機(jī)體后，可引起重要器官病理性損傷幾率增加，甚至誘發(fā)癌癥[3-4]。物理化學(xué)特性如顆粒晶體結(jié)構(gòu)、尺寸、化學(xué)組成等都可影響NPs毒性，其中，顆粒尺寸是NPs較正常顆粒毒性更大的主要因素，較小的尺寸更易進(jìn)入并累積到機(jī)體深層，影響器官及細(xì)胞正?；顒?，顆粒尺寸減小將引起顆粒表面積增大，同時也增加了活細(xì)胞中的化學(xué)反應(yīng)性和顆粒的可穿透性[5-6]。

NPs以吸入(inhalation)、皮膚滲透(dermal penetration)和口服攝入(ingestion)三種最為常見的途徑進(jìn)入人體，隨食物或空氣吞入的NPs主要在小腸被吸收并進(jìn)入血液，吸入的NPs聚集到肺，然后進(jìn)入肺毛細(xì)血管[7-8]。之后，NPs通過血液循環(huán)分布并積累到全身各個器官，甚至通過血腦屏障、胎盤屏障等，其中，肝臟是NPs體內(nèi)積累的最主要靶器官[9]。肝臟對人類健康有重要維護(hù)作用，是人體最主要的代謝及解毒器官，但是，NPs積累到肝臟后，可引起肝細(xì)胞毒性、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、慢性炎癥等，而慢性肝臟炎癥的持續(xù)進(jìn)展和惡性轉(zhuǎn)化可以導(dǎo)致肝癌發(fā)生。因此，NPs對肝細(xì)胞及肝臟的損傷及毒性研究成為評價納米顆粒安全性的重點。

1 納米顆粒對肝臟毒性效應(yīng)

使用最為廣泛的顆粒如納米銀、納米二氧化鈦、納米氧化銅等是近年來研究NPs對肝臟毒性效應(yīng)的重點，已有大量研究證實，這些顆粒能產(chǎn)生明顯肝臟毒性，引起肝酶升高、肝臟炎癥以及肝組織壞死等。

1.1 誘發(fā)肝臟炎癥

NPs誘發(fā)肝臟炎癥可能與促炎因子表達(dá)升高相關(guān)。實驗發(fā)現(xiàn)，雄性Wistar大鼠以氣管滴注的方法每周兩次暴露于0.24 mg/kg納米氧化鎳中，持續(xù)6周后出現(xiàn)肝臟炎癥，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，納米氧化鎳明顯增加了肝臟中促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6的濃度，但降低了抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10的水平[10]。而另一個研究選用直徑1 nm和8 nm的納米鉑給小鼠進(jìn)行靜脈注射，發(fā)現(xiàn)1 nm的納米鉑在給藥后3和6 h均顯著誘導(dǎo)了IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，肝臟出現(xiàn)炎癥，相較而言，8 nm的納米鉑即使在20 mg/kg下也未對小鼠產(chǎn)生明顯毒性[11]。

含有NPs的材料也同樣可能引起肝臟損傷。Saber等[12]研究證實，給小鼠氣管滴注含多壁碳納米管的環(huán)氧樹脂復(fù)合材料機(jī)械磨損產(chǎn)生的粉塵溶液會引起小鼠肝臟炎癥和壞死等組織病理學(xué)改變，但是暴露在不含多壁碳納米管的環(huán)氧樹脂粉塵溶液中的小鼠中未觀察到肝臟的損傷。

1.2 引起肝臟損傷

NPs還可引起肝臟損傷。Alarifi等[13]通過腹膜內(nèi)注射50 nm的納米二氧化鈦后，在小鼠肝臟中觀察到肝臟組織學(xué)變化以及堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)水平的增加，指示肝功能受損嚴(yán)重。用聲輻射力脈沖成像讀取肝臟剪切波速(shear wave velocity，SWV)值并檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，ALT)，發(fā)現(xiàn)吸入二氧化硅納米顆粒能增加SWV和ALT值，誘導(dǎo)大鼠肝損傷[14]。雄性Wistar大鼠通過每周氣管內(nèi)滴注納米氧化鎳(0.015、0.06和0.24 mg/kg)兩次，結(jié)果顯示，納米氧化鎳暴露后，ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、ALP和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶升高，肝細(xì)胞水腫，肝竇消失，嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，肝臟損傷嚴(yán)重[10]。小鼠暴露于200 mg/kg納米氧化鋅90 d 可造成肝臟損傷，包括局灶性肝細(xì)胞壞死、中央靜脈充血擴(kuò)張、ALT和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高[15]。

1.3 改變肝臟結(jié)構(gòu)及功能

NPs還可引起肝臟結(jié)構(gòu)及功能改變。此外，Sun等[16]將斑馬魚胚胎暴露在50 mg/L的納米氧化銅下4 h后，發(fā)現(xiàn)納米氧化銅可引起肝毒性，同時斑馬魚胚胎暴露于高劑量的納米氧化銅中會導(dǎo)致肝臟發(fā)育不良。Vesterdal等[17]給Zucker大鼠經(jīng)口灌胃6.4 mg/kg 的碳黑后，大鼠肝臟的脂質(zhì)負(fù)荷增加，研究認(rèn)為碳黑暴露與肝脂肪變性有關(guān)。Almansour等[18]將雄性Wistar白化大鼠暴露于納米氧化鋅中(每日暴露劑量為2 mg/kg)，持續(xù)21 d后取大鼠的肝臟活組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，他們發(fā)現(xiàn)，與對照組大鼠相比，暴露于納米氧化鋅的大鼠肝組織中出現(xiàn)竇狀擴(kuò)張、小葉和門靜脈三支血管炎性細(xì)胞浸潤、肝組織壞死、水樣變性等。

此外，當(dāng)機(jī)體存在慢性肝病如酒精性肝病、脂肪肝等情況下接觸納米顆粒，更易導(dǎo)致肝臟損傷加劇。有研究用不會引起正常小鼠肝組織毒性的納米銀濃度處理超重小鼠時，納米銀易促使小鼠的脂肪肝發(fā)展為脂肪性肝炎，該研究還發(fā)現(xiàn)納米銀會進(jìn)一步抑制脂肪酸氧化，誘導(dǎo)并增加小鼠肝臟炎癥[19]。Kermanizadeh等[20]將乙醇預(yù)處理小鼠暴露于納米銀后，小鼠的肝臟炎癥和肝臟病變程度惡化，另外，該研究還發(fā)現(xiàn)乙醇影響了肝臟受NPs攻擊后的恢復(fù)能力。

2 納米顆粒毒性效應(yīng)的可能機(jī)制

NPs通過產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)、誘導(dǎo)DNA損傷、損傷細(xì)胞膜、改變基因組甲基化等毒性機(jī)制，誘導(dǎo)肝臟毒性，對肝細(xì)胞及肝臟組織產(chǎn)生損傷，最終影響肝臟正常功能，打破機(jī)體健康。其中，研究普遍認(rèn)為，NPs表現(xiàn)出毒性作用的主要機(jī)制是產(chǎn)生過量ROS，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，而近年來研究也發(fā)現(xiàn)，除了產(chǎn)生ROS，NPs也可直接破壞細(xì)胞膜、擾亂基因表達(dá)等引起肝細(xì)胞和組織壞死。

2.1 產(chǎn)生ROS

NPs可通過三方面誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。其一，部分NPs表面如納米二氧化硅有促氧化功能團(tuán)，當(dāng)與胞內(nèi)氧化劑結(jié)合后可直接產(chǎn)生ROS；其二，當(dāng)NPs進(jìn)入細(xì)胞的線粒體后，它們會損傷電子傳遞鏈、引起線粒體膜的去極化，而受損線粒體則會產(chǎn)生大量ROS；其三，NPs進(jìn)入細(xì)胞中會激活包括巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞，活化的免疫細(xì)胞則會增加ROS的產(chǎn)生[21]。由NPs誘導(dǎo)的胞內(nèi)過量 ROS 生成及其引起的胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)正是導(dǎo)致細(xì)胞、組織損傷甚至細(xì)胞死亡的主要原因之一。其中，ROS可與DNA發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DNA氧化，DNA鏈斷裂，形成DNA損傷的生物標(biāo)志物即8-氧代-7，8-二氫-2 -脫氧鳥苷 (8-oxo-7，8-dihydro-2 -deoxyguanosine) ，并誘導(dǎo)微核形成，產(chǎn)生明顯遺傳毒性[22]，也可與脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化物，破壞及損傷生物大分子，影響細(xì)胞功能。

2.2 損傷細(xì)胞膜

NPs可直接(物理損傷)或間接(氧化損傷)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Salatin等[23]發(fā)現(xiàn)，帶正電荷的NPs能增加與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜的相互作用，從而增加細(xì)胞吞噬作用，破壞細(xì)胞膜功能。此外，NPs還可通過產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化來影響細(xì)胞膜完整性和功能穩(wěn)定[24]。

2.3 形成蛋白質(zhì)電暈

NPs進(jìn)入生物環(huán)境中導(dǎo)致帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)吸附在帶正電荷的顆粒上，形成蛋白質(zhì)電暈(protein corona)。蛋白質(zhì)電暈會改變NPs的尺寸、聚集狀態(tài)以及表面性質(zhì)，也會影響細(xì)胞對NPs的攝取[25]，此外，胞內(nèi)蛋白質(zhì)也因吸附帶電納米顆粒而改變其分子構(gòu)象及折疊，最終失活。研究發(fā)現(xiàn)，吸附在超順磁性納米氧化鐵上時，轉(zhuǎn)鐵蛋白會因構(gòu)象修飾而失活[26]。另外，納米二氧化鈦對磷酸鹽基團(tuán)具有高度親和力，它會結(jié)合蛋白質(zhì)的磷酸化形式，干擾涉及磷酸化-去磷酸化反應(yīng)的細(xì)胞過程，比如在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中的級聯(lián)放大反應(yīng)，有研究猜想這可能是納米二氧化鈦損傷如DNA修復(fù)過程等細(xì)胞內(nèi)信號通路的一種方式[27]。

2.4 改變基因組甲基化狀態(tài)

NPs可通過改變DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)及活性，影響DNA甲基化水平，從而影響全基因組表觀遺傳修飾，這可能在NPs致癌過程中起重要作用。Mytych等[28]發(fā)現(xiàn)納米金剛石能促使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)上調(diào)，引起癌細(xì)胞基因組高甲基化。Bai等[29]研究亦表明，納米二氧化鈦會增加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，從而引起DNA修復(fù)蛋白啟動子甲基化異常。

3 減少納米顆粒產(chǎn)生肝臟毒性的策略

基于NPs最主要毒性是產(chǎn)生ROS，近來，部分研究也著力于找出可有效代謝、控制ROS的抗氧化劑，以對NPs引起的肝臟毒性起到緩解作用。Niu等[30]發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素提取物(grape seed procyanidin extract，GSPE)可以劑量依賴的方式降低暴露在納米二氧化鈦中小鼠細(xì)胞的DNA損傷、ROS生成及丙二醛積累，有效阻止了小鼠暴露于納米二氧化鈦下肝的組織病理學(xué)和生物標(biāo)志物的改變。Azim等[31]發(fā)現(xiàn)口服納米二氧化鈦導(dǎo)致MDA水平升高，小鼠肝臟谷胱甘肽表達(dá)降低，DNA損傷明顯，而在納米二氧化鈦暴露后1個月，肌鈦和維生素E的組合口服治療，可減弱小鼠肝臟的毒性作用。

Sonane等[32]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦和氧化鋅可誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS并提高秀麗線蟲致死率，但姜黃素和維生素C可在納米顆粒存在的情況下提高線蟲生存率，降低ROS的產(chǎn)生。該研究也提出將姜黃素和維生素C并入日常飲食可避免納米毒性，抗氧化劑的膳食補(bǔ)充在對抗NPs的毒性以及致死性方面非常有效，并可提供機(jī)體抵抗進(jìn)一步暴露的能力。

4 展望

目前，NPs毒性研究已逐漸深入，研究者們試圖從不同層面來解析NPs的致毒機(jī)制，以便更好對各種納米材料進(jìn)行安全性評價。NPs引起的氧化損傷容易導(dǎo)致組織發(fā)生炎癥，而人類及環(huán)境的NPs暴露濃度較低，往往不能在短期出現(xiàn)急性損傷，但容易產(chǎn)生慢性炎癥，因此，NPs對肝臟毒性的評估也應(yīng)把長期低劑量暴露考慮在內(nèi)。此外，檢測、靶向、治療且不產(chǎn)生副作用的納米腫瘤學(xué)方面的研究也正在興起，NPs由于尺寸小，可進(jìn)入到機(jī)體任何細(xì)胞當(dāng)中，有研究也發(fā)現(xiàn)，納米銀、納米金及納米銀/金混合物可在二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導(dǎo)的肝癌中起到保肝活性，它們可特異性殺死肝癌細(xì)胞，對肝癌有潛在的抗癌活性，但不影響動物的體質(zhì)量，因此，研究也認(rèn)為納米銀和納米金可能具備有效納米藥物開發(fā)的潛力[33]。這項研究給我們以啟示，如果確定某種NPs可定向損傷某類細(xì)胞群體，將會極大推進(jìn)腫瘤靶向治療。最后，在日常飲食中使用抗氧化劑作為減緩納米毒性的方法還需進(jìn)行大量研究，以便在目前尚不能對NPs進(jìn)行準(zhǔn)確的安全性評價的情況下，我們可通過簡單有效的方法避免NPs引起的慢性炎癥，降低退行性疾病發(fā)生風(fēng)險。