Cu-MOFs固定化酶制備及染料降解應用研究

高霞，張國春，喬成芳

（商洛學院化學工程與現(xiàn)代材料學院/陜西省尾礦資源綜合利用重點實驗室，陜西商洛 726000）

酶是一種高效、綠色的生物催化劑，具有特異性好、反應條件溫和、較廣泛的來源等優(yōu)點。但是游離酶難以回收和不能與反應物分離，限制了其在工業(yè)中的廣泛應用[1]，實現(xiàn)酶的固定化是解決這一問題的主要途徑。染料廢水的降解一直是一個熱點話題，染料因其毒性強、種類多、色度大等性質，不僅有誘發(fā)人類癌癥的可能，而且給環(huán)境保護造成了極大的威脅，而固定化酶一個最大的用途是處理廢水中的有毒物質，防止水體污染[2-7]。金屬有機骨架材料（MOFs）是一類具有優(yōu)良吸附性能的多孔材料，近年來在催化、光電、生物等領域具有廣闊的應用前景[8-16]，可作為一種理想的固定化酶載體[17]。目前文獻中報道的使用MOFs材料固定化酶主要有“一鍋法”和“兩步法”兩種方法。“一鍋法”[18-23]是將游離酶與形成MOF材料的原料液直接混合，溫和的條件下制備得到，此方法制備過程簡單，但由于絕大多數(shù)酶為水溶性生物大分子，因此要求作為載體的MOF材料在水溶液中必須是穩(wěn)定存在的，同時制備過程不能在極端條件下（如高溫、強酸堿、有機溶劑等）進行?！皟刹椒ā笔窍群铣蒑OFs，然后通過吸附、包埋、共價結合等方式實現(xiàn)酶的固定化；吸附法[24]和包埋法[25]要求MOFs材料的孔徑足夠大，然而目前報道的大多數(shù)MOFs材料都是微孔材料，很難被用于吸附大分子的蛋白質，在生物和環(huán)境方面還有一定的局限；而共價結合[26]要求MOFs材料表面要有可以與酶形成共價鍵的基團，且基團活化和修飾步驟繁瑣。利用MOFs自身的優(yōu)點，設計制備多級孔MOFs作為一種固定化酶的新型載體用于工業(yè)廢水中有毒物質的處理，相比于常規(guī)的沸石等無機載體，吸附量和酶活的保留都會大大加強。本文利用共模板導向組裝法制備得到了兩種不同孔徑大小的多級孔Cu-MOFs材料，選擇這兩種多級孔Cu-MOFs材料為載體，對氯過氧化物酶（CPO）進行固定，并研究了固定化酶在染料降解中的應用。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

1,3,5 -苯三甲酸（H3BTC），分析純（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；Cu(NO3)2·3H2O、檸檬酸（CA）、溴化鉀（KBr）、30%過氧化氫均為分析純（國藥集團）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），分析純（上海山浦化工有限公司）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、無水乙醇均為分析純（天津化學試劑廠）；結晶紫，分析純（天津市福晨化學試劑廠）；2,2'-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS），98%（Sigma-Aldrich公司）；氯過氧化物酶[27]（CPO,Rz＝1.34）（實驗室提供）；全自動X-射線衍射儀，D/Max-3C型（日本Rigalcu）；紫外可見分光光度計，UV-1700型（島津國際貿易上海有限公司）；高速冷凍離心機，GL-20B型（上海安亭科學儀器廠）；恒溫培養(yǎng)振蕩器，SKY-200B型（上海蘇坤實業(yè)有限公司）；物理吸附儀，ASAP 2020 PLUS HD88系列（麥克默瑞提克（上海）儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱，202型（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 多級孔Cu-MOFs的制備

溶劑熱反應條件下，選擇陰離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）為結構導向劑，羥基羧酸檸檬酸（CA）為螯合劑形成的共模板體系，通過調節(jié)CTAB的用量得到兩種不同孔徑大小的多級孔Cu-MOFs材料，分別標記為H-Cu-MOF-0.1和H-Cu-MOF-0.2。其中H-Cu-MOF-0.1的具體制備過程如下：先將0.232 g Cu(NO3)2·3H2O，0.116 g H3BTC 和 10 mL DMF置于20 mL耐熱玻璃瓶中，磁力攪拌30 min。然后加入0.1 g CTAB和0.05 g CA，繼續(xù)攪拌30 min，密封后在2 h內升溫至75℃，恒溫24 h，然后緩慢冷卻至室溫，經(jīng)過濾，DMF洗滌，真空干燥后得藍色固體粉末。將所得固體粉末產(chǎn)物用脫脂濾紙包好后置于索氏提取器中回流提純（放置時上下端填充脫脂棉），提純5次，每次提純加入25 mL濃鹽酸和125 mL乙醇，溫度為100℃，回流時間為6 h。最后，樣品在60℃真空干燥12 h備用。H-Cu-MOF-0.2的制備過程類似于H-Cu-MOF-0.1，不同之處是CTAB的用量增加為0.2 g。

1.3 固定化酶的制備

將10 mg載體材料加入1.5 mL含2.5 μmol·L-1CPO的pH=2.75的磷酸緩沖液（PBS）中，在30℃的恒溫振蕩器中以200 r·min-1的轉速振蕩40～50 min，將混合物以 8000 r·min-1的轉速離心4 min，分離上清液與固體，并用緩沖液洗滌除去載體表面游離的CPO，30℃真空干燥12 h后在4℃下干燥保存。通過計算加入的CPO的量與上清液中沒有固載上的CPO的量來計算酶的固載率。固載率的計算公式為：

式(1)中，Apre為CPO固定前的吸光度值；Apost為CPO固定后上清液的吸光度值。固載量的計算公式為：

式(2)中，△A398為CPO在紫外波長398 nm處的吸光度值；ε為CPO的摩爾吸光系數(shù)（91 200 L·mol-1·cm-1）；V 為實驗體系最終的體積；m為加入載體的質量；l為實驗中所用比色皿的寬度（cm）。

1.4 固定化酶的性質

1.4.1 固定化酶活性測定

根據(jù)文獻[28-29]報道，CPO催化ABTS生成ABTS·＋的過氧化反應為模型反應可用來測定固定化CPO的過氧化活性。ABTS經(jīng)CPO催化和H2O2氧化轉化為ABTS·＋陽離子自由基的過氧化反應（見圖1），反應溶液由無色變?yōu)樗{綠色，在415 nm處出現(xiàn)ABTS·＋陽離子自由基的特征吸收峰。

圖1 CPO催化ABTS生成ABTS·+的過氧化反應

由于在415 nm處ABTS·＋自由基的吸光系數(shù)遠大于底物ABTS，隨著ABTS·＋自由基濃度的增加，在415 nm處吸光度值變大，因此要檢測ABTS·＋在415 nm處吸光度的增加。具體過程如下：在2 mL離心管中分別加入一定量濃度為0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液，30μL濃度為0.01 mol·L-1的ABTS，一定量的H2O2和10 μL濃度為0.05μmol·L-1的游離CPO溶液或等量的固定化CPO，于恒溫下在轉速為200r·min-1的恒溫振蕩器中反應30min，離心，測定上清液在415 nm處吸光度值，根據(jù)其摩爾吸光系數(shù)ε計算轉化率。

1.4.2 熱穩(wěn)定性

在20℃～100℃溫度下將一定量的游離CPO和含有等量CPO的固定化酶放置溫育1 h，再將溫育過的游離CPO和固定化酶分別催化ABTS過氧化反應，比較游離CPO和固定化酶的熱穩(wěn)定性。

1.4.3 重復使用性

將10 mg固定化酶用于ABTS過氧化反應，反應30 min后離心測定上清液在415 nm處的吸光度值，將剩余的固定化酶材料再次用于催化ABTS過氧化反應，以第一次ABTS轉化率記作100%，將之后每次的轉化率與第一次的比較，以殘余催化活性表征固定化酶的重復使用性。

1.5 染料降解試驗

在2 mL離心管中加入10 mg固定化酶，1 395 μL 濃度為 0.1 mol·L-1，pH＝3 的磷酸緩沖液，75 μL 濃度為 10 mmol·L-1的結晶紫溶液以及 30 μLH2O2，反應 30 min 后，離心，測定上清液在583 nm處吸光度值。

2 結果與討論

2.1 多級孔Cu-MOFs及其固定化酶的結構表征

2.1.1 N2吸附分析

本試驗在HKUSK-1合成體系中，利用超分子模板劑CTAB和螯合劑CA的共同作用實現(xiàn)對材料孔徑的調控，將制備的兩種材料經(jīng)180℃下過夜脫氣后，在液氮溫度下（77 K）進行氮氣吸脫附測試，試驗結果見圖2、表1。由圖2可知，這兩種材料的N2吸脫附曲線具有較明顯的第IV類N2吸脫附等溫線特征，屬于典型的介孔固體材料的吸附，存在滯后環(huán)，表明這兩種材料均具有介孔結構。由表1可知，兩種材料的微孔孔徑均為0.83 nm，這與文獻報道的0.85 nm基本接近，證明這兩種材料為目標產(chǎn)物。同時H-Cu-MOF-0.1和H-Cu-MOF-0.2均具有較高的比表面積和孔體積，BET 比表面積（SBET）分別為 981.50 m2·g-1和1 087.49 m2·g-1，孔體積（Vt）分別為0.493 cm3·g-1和 0.557 cm3·g-1， 介孔孔徑分別為 2.0、4.6、11.0 nm和2.0、4.8、12.0 nm。以上結果進一步證明最終成功制備了兩種不同孔徑大小的多級孔材料。

圖2 多級孔Cu-MOFs材料的N2吸脫附

表1 多級孔Cu-MOFs材料的合成條件和孔性質

2.1.2 X-射線粉末衍射分析

多級孔Cu-MOFs材料及其固定化酶的室溫粉末衍射結果見圖3。由圖3可知，所制備的兩種多級孔Cu-MOFs材料及其固定化酶的XRD譜圖與標準XRD譜圖衍射峰吻合的較好，由此說明這兩種材料為目標產(chǎn)物，同時也說明CPO的引入不會導致多級孔Cu-MOFs材料骨架的坍塌。

圖3 多級孔Cu-MOFs材料及其固定化酶的粉末衍射圖和Cu-BTC的標準模擬圖

2.2 固定化條件的優(yōu)化

本試驗所用的固定化方法是物理吸附法，固定化條件的優(yōu)化是按照1.3的實驗步驟，分別對固定化過程的pH、溫度以及固定時間進行了考察，結果見圖4。如圖4可知，H-Cu-MOF-0.1和H-Cu-MOF-0.2固定CPO的較佳固定化時間分別為40 min和50 min，較佳pH均為2.75，較佳固定化溫度均為30℃，較佳固載量分別為14.51mg·g-1和 21.41 mg·g-1。

圖4 固定化條件對CPO固定化效率的影響

2.3 固定化酶的性質

2.3.1 熱穩(wěn)定性

將游離CPO和固定化酶在20℃～90℃內不同溫度下溫浴1 h檢測其相對活性，結果見圖5。由圖5可知，游離CPO的較佳反應溫度為30℃，而固定化酶的較佳反應溫度均為40℃。以較佳反應溫度下的活性為標準，考察不同溫度下CPO的相對活性，當溫度升至50℃時，游離CPO僅能保持41.02%的催化活性，而CPO@H-Cu-MOF-0.1仍能保持84.93%的催化活性，CPO@H-Cu-MOF-0.2仍能保持88.94%的催化活性；當溫度升至60℃時，游離CPO的殘余活性僅剩23.33%，而CPO@H-Cu-MOF-0.1和CPO@H-Cu-MOF-0.2在 70℃仍能保持52.73%和64.04%的催化活性。實驗結果表明，固定化酶的熱穩(wěn)定性較游離酶顯著提高，這是因為載體材料為游離酶抵御高溫提供了屏障，減弱了溫度對固定化酶構象的影響。

圖5 游離CPO和固定化CPO的熱穩(wěn)定性

2.3.2 重復使用性

固定化酶的重復使用性研究結果見圖6。由圖6可知，隨著重復使用次數(shù)的增加，固定化酶的催化活性緩慢下降，CPO@H-Cu-MOF-0.1和CPO@H-Cu-MOF-0.2在重復使用5次后，分別保持65.25%和76.38%的催化活性。CPO@H-Cu-MOF-0.1在重復使用7次之后仍能保持43.44%的催化活性，而CPO@H-Cu-MOF-0.2在重復使用7次后仍能保持48.35%的催化活性，表明固定化酶具有良好的重復使用性。

圖6 固定化CPO的重復使用性

2.4 染料降解應用研究

基于CPO的氧化活性，將本試驗制備的兩種固定化酶材料應用于三苯甲烷類染料結晶紫的氧化降解反應中，通過對溫度、H2O2濃度、染料濃度和磷酸緩沖液的pH進行優(yōu)化，得到這兩種固定化酶材料降解結晶紫的較佳降解條件分別為 H2O2濃度 10.0 mmol·L-1、 溫度 30 ℃、結晶紫濃度 2.0 mmol·L-1、pH 3.0。試驗結果見圖7、圖8。染料降解率的具體計算公式為：

式(4)中，A0為降解前，染料在其紫外特征吸收峰處的吸光度值；At為降解后，染料在其紫外特征吸收峰處的吸光度值。

圖7 固定化CPO降解結晶紫效果圖

圖8 降解結晶紫的紫外光譜圖

由圖7和圖8可以看出，本試驗制備的這兩種固定化酶材料 CPO@H-Cu-MOF-0.1和CPO@H-Cu-MOF-0.2均能使結晶紫染料脫色，而且發(fā)色團基本被破壞。由圖9可以得知，CPO@H-Cu-MOF-0.2對染料結晶紫的降解效果較好，3 min內降解率就可以達到91.11%，10 min時降解率達到94.63%，30 min時降解率幾乎為100%，而CPO@H-Cu-MOF-0.1的降解時間相對較長，3 min內降解率為 60.56%，20 min時降解率達到 90.93%，30 min 時降解率為 91.67%。

圖9 時間對結晶紫降解率的影響

3 結論

利用多級孔Cu-MOFs材料為載體固定CPO，在 CPO 2.5 μmol·L-1，pH 2.75 下固定 40～50 min，成功得到兩種活性較高的固定化酶，并對固定化酶的性質進行研究，結果表明，這兩種固定化酶的熱穩(wěn)定性較游離CPO均明顯增強，同時具有良好的重復使用性，在重復使用5次后，仍能保持大于65%的催化活性。此外，還探討了固定化酶在三苯甲烷類染料結晶紫降解中的應用，結果表明其對染料結晶紫的催化降解效果顯著，此類固定化酶材料作為一種綠色的固體催化劑在工業(yè)廢水中有毒物質處理方面有著極為廣闊的應用前景。