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    東北市售雞肉中空腸彎曲桿菌的分離鑒定、分型及耐藥性分析

    2018-08-01 08:04:52鵬趙勝娟姜亦超江巖劉麗莉肖楓張慧蕓唐浩國(guó)康懷彬
    食品與機(jī)械 2018年6期
    關(guān)鍵詞:市售空腸雞肉

    費(fèi) 鵬趙勝娟姜亦超江 巖劉麗莉肖 楓張慧蕓唐浩國(guó)康懷彬

    (1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023;2. 長(zhǎng)白山食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,吉林 白山 134500;3. 穆棱市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,黑龍江 牡丹江 157500 )

    空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)是常見(jiàn)的食源性致病菌之一,主要存在于家畜家禽等動(dòng)物體內(nèi),其中雞是最易攜帶該致病菌的動(dòng)物[1-3]。中國(guó)是雞肉的消費(fèi)大國(guó),食用未煮熟的雞肉是感染空腸彎曲桿菌的主要原因,感染該致病菌會(huì)導(dǎo)致患者腹瀉、關(guān)節(jié)炎和格林-巴利綜合征等疾病,嚴(yán)重地危害了消費(fèi)者的健康[4-5]??漳c彎曲桿菌具有高度的遺傳多樣性,且對(duì)抗生素有較強(qiáng)的耐藥性,給充分認(rèn)識(shí)和有效控制該致病菌帶來(lái)了難題[6-7]。

    對(duì)空腸彎曲桿菌遺傳多樣性的研究有助于揭示特定環(huán)境中該致病菌的種群特征,增加對(duì)空腸彎曲桿菌的認(rèn)識(shí),該方向的研究已被研究者們關(guān)注[8-10]。陳荀等[11]利用脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)對(duì)雞肉產(chǎn)業(yè)鏈中(糞便、屠宰場(chǎng)中雞肉)的空腸彎曲桿菌進(jìn)行了分型研究,結(jié)果表明,83株供試菌株被分為了45個(gè)不同的分子型,揭示了雞肉產(chǎn)業(yè)鏈中該致病菌的分子特征。脈沖場(chǎng)電泳技術(shù)的結(jié)果并不能揭示基因?qū)用娴男畔ⅲ浣Y(jié)果也不能實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室之間的數(shù)據(jù)共享,而多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence typing,MLST)技術(shù)能夠彌補(bǔ)上述不足[12]。Ma等[6]利用MLST技術(shù)對(duì)天津地區(qū)市售雞肉中的空腸彎曲桿菌進(jìn)行了分析,研究發(fā)現(xiàn)42株空腸彎曲桿菌被分成了22個(gè)不同的序列型(Sequence Type,ST),并分析了不同STs空腸彎曲桿菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。洪捷等[13]則利用MLST技術(shù)研究了分離自江蘇地區(qū)空腸彎曲桿菌的種群特征,31株空腸彎曲桿菌被分成了21個(gè)STs。上述報(bào)道一定程度上揭示了禽肉及雞肉產(chǎn)業(yè)鏈中空腸彎曲桿菌的遺傳多樣性,然而關(guān)于東北地區(qū)市售雞肉中的空腸彎曲桿菌種群特征的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

    目前,使用抗生素是治療空腸彎曲桿菌感染最有效和常用的方法。然而,隨著抗生素的濫用和長(zhǎng)時(shí)間的使用,菌株很有可能產(chǎn)生耐藥性。黃金林等[14]發(fā)現(xiàn)奶牛源的空腸彎曲桿菌具有多重耐藥性。周倩等[15]分析了禽源的空腸彎曲桿菌的耐藥性,發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)92.6%的抗生素都具有耐藥性的菌株。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的紅外突變處理能夠顯著地提高空腸彎曲桿菌桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、萘啶酸、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、氯霉素和慶大霉素的耐受性。這些研究表明,對(duì)空腸彎曲桿菌進(jìn)行及時(shí)的耐藥性監(jiān)測(cè)是非常必要的。

    本研究以東北地區(qū)市售雞肉為研究對(duì)象,對(duì)其空腸彎曲桿菌的污染情況進(jìn)行調(diào)查,利用MLST技術(shù)分析其遺傳多樣性,系統(tǒng)地揭示東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的種群特征。在此基礎(chǔ)上,對(duì)分離株進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè),以期為市售雞肉中空腸彎曲桿菌的防控提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    樣品采集:2017年1月~11月,采集東北地區(qū)市售的雞肉樣品1 000份,其中雞胸肉和雞翅各500份,用無(wú)菌棉簽擦拭(3 cm×3 cm),并保存在磷酸鹽(phosphate buffered saline,PBS)緩沖液中,低溫保存運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室;

    溶菌肉湯(Lysogeny Broth, LB)、PBS緩沖液、脫纖維綿羊血、CCDA選擇性培養(yǎng)基:青島海博生物技術(shù)有限公司;

    21種藥敏紙片:北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司;

    引物合成:蘇州金唯智生物科技有限公司;

    細(xì)菌全基因組DNA試劑盒、2×PCR Master Mix:天根生化科技(北京)有限公司。

    1.2 主要儀器設(shè)備

    高速臺(tái)式離心機(jī):GT10-1型,北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;

    高壓滅菌鍋:SANYO型,上海迭戈生物科技有限公司;

    恒溫培養(yǎng)箱:DNP-9272A型,常州諾基儀器有限公司;

    電泳儀:BIO-RAD型,北京伯樂(lè)生命科學(xué)發(fā)展有限公司;

    生物潔凈工作臺(tái):BCW-1000型,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;

    PCR儀:Veriti?型,北京昊諾斯科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 空腸彎曲桿菌的分離鑒定 根據(jù)周倩等[15]的方法,取100 μL PBS稀釋液,對(duì)其進(jìn)行分離純化。挑取單菌落,接種在5%脫纖維羊血的LB肉湯培養(yǎng)基中,在微需氧(10% CO2,5% O2,85% N2)、37 ℃的條件下培養(yǎng)48 h。吸取空腸彎曲桿菌菌液2 mL,根據(jù)細(xì)菌全基因組DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)其進(jìn)行DNA提取,利用16S rRNA 測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鑒定。

    1.3.2 看家基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序 按照Lévesque等[16]的報(bào)道合成引物(aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA),以空腸彎曲桿菌 DNA 為模板,對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(50 μL)為:DNA模板2 μL,2×PCR Master Mix 25 μL,雙蒸水23 μL。7對(duì)引物的反應(yīng)體系相同,均為:94 ℃預(yù)變性10 min,30個(gè)循環(huán)(94 ℃,1 min;50 ℃,1 min;72 ℃,1 min),最后72 ℃延伸10 min。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序分析。

    1.3.3 空腸彎曲桿菌MLST分析 登陸空腸彎曲桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubmlst.org/campylobacter/),將看家基因的基因測(cè)序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),得到7個(gè)看家基因的等位基因號(hào),并根據(jù)7個(gè)等位基因號(hào)確定空腸彎曲桿菌的序列型(Sequence Type,ST),并利用MEGA6.0軟件對(duì)串序列進(jìn)行最小似然系統(tǒng)發(fā)育分析。

    1.3.4 空腸彎曲桿菌的耐藥性分析 選取8種抗生素,利用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的K-B瓊脂擴(kuò)散法,分析空腸彎曲桿菌的耐藥性。將活化的菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞舛龋缓蟾鶕?jù)藥敏紙片說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)試,在微需氧、37 ℃ 的條件下培養(yǎng)48 h,根據(jù)抑菌圈直徑的大小(mm)按CLSI/NCCLS評(píng)估空腸彎曲桿菌的耐藥性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況

    東北地區(qū)1 000份市售雞肉中共有62份空腸彎曲桿菌陽(yáng)性樣品,總污染率為6.2%,具體見(jiàn)表1。62份陽(yáng)性樣品中雞胸肉樣品37份(7.4%),雞翅樣品25份(5.0%),可見(jiàn)雞胸肉中空腸彎曲桿菌的污染率高于雞翅。東北5個(gè)不同地區(qū)市售雞肉空腸彎曲菌的污染率分別為5.5%(A)、5.5%(B)、7.5%(C)、6.0%(D)、6.5%(E)。在2012年和2013年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)雞肉中空腸彎曲桿菌的污染分別為11.5%[17]和1..66%[18],本研究中東北地區(qū)市售雞肉中該致病菌的污染率為6.2%,明顯低于之前的污染率。

    表1 東北地區(qū)市售雞肉空腸彎曲桿菌污染情況?

    Table 1 The contamination ofC.jejuniin commercial chicken in Northeast China

    %

    ? 樣品數(shù)為100。

    2.2 東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的MLST分析

    將62株空腸彎曲桿菌看家基因的序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),得到看家基因等位基因號(hào)和ST,結(jié)果見(jiàn)表2。62株空腸彎曲桿菌被分為了14個(gè)ST,分別為ST1(15株)、ST5(24株)、ST28(2株)、ST52(4株)、ST64(4株)、ST88(3株)、ST90(1株)、ST236(1株)、ST456(2株)、ST751(1株)、ST905(1株)、ST1222(2株)、ST3228(1株)和ST3242(1株),說(shuō)明該致病菌具有較高的遺傳多樣性。其中ST5和ST1型的空腸彎曲桿菌分別占總菌株數(shù)的31.87% 和24.19%,是雞肉中空腸彎曲桿菌的優(yōu)勢(shì)ST。在董俊等[19]的研究中顯示分離自湖北地區(qū)禽類(lèi)的空腸彎曲桿菌的優(yōu)勢(shì)ST353和ST464。這些與本研究的結(jié)果并不一致,是因?yàn)榭漳c彎曲桿菌的分離地區(qū)和來(lái)源不同,說(shuō)明不同地區(qū)和來(lái)源的空腸彎曲桿菌在種群組成上存在差異。

    表2 62株空腸彎曲桿菌MLST分析結(jié)果

    2.3 不同ST空腸彎曲桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

    以不同ST的空腸彎曲桿菌看家基因串聯(lián)序列為研究對(duì)象,利用MEGA6.0軟件構(gòu)建最小似然算法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),得到了清晰的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)圖1。在14個(gè)不同的ST中,ST90和ST456,ST88和ST1222之間具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,說(shuō)明上述2組ST的菌株可能具有相近的生物學(xué)特性和侵染特性。ST3242明顯遠(yuǎn)離了其他13個(gè)ST,說(shuō)明ST324的空腸彎曲桿菌與其他菌株親緣上有一定的距離,因此該菌株應(yīng)該進(jìn)行進(jìn)一步的研究,確定其是否有獨(dú)特的侵染和致病能力。

    圖1 不同ST空腸彎曲桿菌7個(gè)看家基因串聯(lián)序列最小似然系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

    Figure 1 Maximum-likelihood tree of splicing sequence of 7 housekeeping genes inC.jejuniwith different STs

    2.4 空腸彎曲桿菌耐藥性分析

    62株空腸彎曲桿菌對(duì)8種抗生素的耐藥性分析結(jié)果見(jiàn)表3,在8種抗生素中對(duì)環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明的耐受率為0%,對(duì)其他6種抗生素的耐受率分別為91.94%(紅霉素),88.71%(慶大霉素),74.19%(克林霉素),38.71%(青霉素),25.81%(四環(huán)素),6.45%(頭孢噻肟)。這些結(jié)果表明空腸彎曲桿菌對(duì)大多數(shù)的抗生素都產(chǎn)生了耐藥性,而所有的受試菌株都不耐受環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明,因此可以利用這2種抗生素預(yù)防和治療空腸彎曲桿菌的感染。

    表3 62株空腸彎曲桿菌耐藥性分析

    3 結(jié)論

    本研究調(diào)查了東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況,其污染率為6.2%。62株空腸彎曲桿菌被分為了14個(gè)ST,分別為ST1、ST5、ST28、ST52、ST64、ST88、ST90、ST236、ST456、ST751、ST905、ST1222、ST3228和ST3242,其中ST5和ST1為優(yōu)勢(shì)的STs,說(shuō)明空腸彎曲桿菌具有豐富的遺傳多樣性。抗生素耐藥性分析表明空腸彎曲桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明和頭孢噻肟具有高度的敏感性,而對(duì)紅霉素、慶大霉素、克林霉素、青霉素和四環(huán)素的耐受性較強(qiáng)。本研究的結(jié)果有助于了解東北地區(qū)市售雞肉中空腸彎曲桿菌的污染情況、種群特征和抗生素耐藥性,為了進(jìn)一步揭示環(huán)境對(duì)空腸彎曲桿菌種群特征的影響,接下來(lái)的研究將用更為先進(jìn)的全基因組測(cè)序技術(shù)分析空腸彎曲桿菌的遺傳進(jìn)化特性,并挖掘與耐藥性相關(guān)的功能基因。

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