高壓靜電場激勵裙帶菜配子體的生物效應(yīng)研究

李曉麗，蘆瑩，胡玉才，孫丕海，邢冬飛

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023;2.大連海洋大學(xué) 理學(xué)院，遼寧 大連 116023;3.大連海洋大學(xué) 科技園有限公司，遼寧 大連 116023)

裙帶菜Undariapinnatifida是中國北方沿海大規(guī)模栽培的經(jīng)濟褐藻，2017年栽培面積為7200余hm2，年產(chǎn)鮮品裙帶菜20余萬t，其中遼寧省大連市是中國裙帶菜栽培生產(chǎn)的主要基地，生產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的80%以上，裙帶菜栽培業(yè)已經(jīng)成為大連沿海漁業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)，也是出口創(chuàng)匯最重要的水產(chǎn)品之一[1]。目前，裙帶菜產(chǎn)業(yè)中的苗種生產(chǎn)主要采用全人工育苗和半人工育苗兩種方式，但全人工育苗使用的種菜逐年反復(fù)利用會導(dǎo)致近交衰退，半人工育苗方式會導(dǎo)致海上栽培品種和野生群體的混雜，栽培品種在使用數(shù)年之后，產(chǎn)量、質(zhì)量、抗病能力均大幅度下降[2]，因此，亟須開展裙帶菜優(yōu)良品種的選育工作，培育出適合大連當(dāng)?shù)睾Ｓ驐l件的養(yǎng)殖品種。

當(dāng)前裙帶菜品種選育主要依靠選擇育種和雜交育種兩種方式，已有“海寶1號”和“海寶2號”兩個新品種，但是同樣存在著選育周期長、工作量大的問題[2]，而誘變育種能快速地篩選經(jīng)濟性狀優(yōu)良的品種，在輻射誘變中一般是以60Co-γ射線為輻射源對植物進行誘變，但因其設(shè)備價格昂貴、輻射傷害人體，生產(chǎn)中應(yīng)用有限。研究表明，使用構(gòu)造簡單、操作方便、安全系數(shù)大的高壓靜電場處理可以獲得同樣的誘變效果[3]，如在黑曲霉[4]、大腸桿菌K12[5]的誘變中作用效果顯著，此外，高壓靜電場處理還具有提高種子活力、促進種子發(fā)育生長、提高種子品質(zhì)等作用[6-10]。因此，筆者所在的科研團隊于2014—2016年，對優(yōu)選的DL18品系裙帶菜配子體進行高壓靜電場處理，再將處理后的配子體進行采苗及育苗，觀察配子體的生長、成熟和孢子體的生長發(fā)育情況，比較F1代孢子體的經(jīng)濟性狀，并對F1代配子體進行rbcL-sp-S基因序列分析。本試驗中，激勵裙帶菜配子體，根據(jù)試驗結(jié)果，掌握了適宜的處理強度和處理時間，可為高壓靜電場在裙帶菜的育種和品質(zhì)改良中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種及保存條件 在大連地區(qū)養(yǎng)殖成熟的日本北方型種源裙帶菜中，挑選具有優(yōu)良性狀的種菜，采集游孢子，獲得不同品系的裙帶菜配子體，其中以DL18品系裙帶菜藻體最大(圖1)，因此，本研究中以DL18品系的雌、雄配子體為試驗材料，保存培養(yǎng)溫度為18～20 ℃，光照強度為20 μmol/(m2·s)，光源為LED燈，光照時間為12 h/d。

圖1 DL18品系裙帶菜孢子體Fig.1 A sporophyte of DL18 strain of sea mustard Undaria pinnatifida

1.1.2 高壓靜電處理裝置 依據(jù)白亞鄉(xiāng)等[10]的方法，高壓靜電處理裝置為ZGF-60 kV型直流高壓發(fā)生器(大連電源技術(shù)有限公司)，把220 V交流電壓整流到0～60 kV，輸出電流在0.05～2.00 mA，自行設(shè)計兩平行鋁板(圓形，Ф=20 cm)，板間距可調(diào)節(jié)，下極板接地，上極板加負電場強度。處理時，將盛有配子體的培養(yǎng)皿(Ф=12 cm，下同)置于兩極板正中央，由于培養(yǎng)皿面積小于兩極板，故可視培養(yǎng)皿內(nèi)為勻強電場，無邊緣效應(yīng)(圖2)。

圖2 高壓靜電處理裝置Fig.2 Schematic diagram of an electrostatic field device

1.2 方法

1.2.1 不同電場強度和處理時間對裙帶菜配子體存活率的影響試驗 各稱取0.1 g(濕質(zhì)量，下同)DL18品系配子體(雌、雄各半，下同)，放入培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)液深度為0.6 cm條件下，分別在3.3、4.0、4.7、5.3、6.0 kV/cm電場強度下，各處理2、5、10 min，對照組為未處理的DL18品系配子體，各試驗組均設(shè)3個平行(下同)。

1.2.2 高壓靜電場處理對配子體特定生長率及成熟率、受精率的影響試驗 各稱取0.1 g DL18品系配子體，分別在不同電場強度下處理10 min后，將配子體經(jīng)組織搗碎機[11]切碎成400～500 μm 的藻段，移入培養(yǎng)皿(Ф=15 cm)中，置于22 ℃、光照強度60 μmol/(m2·s)、光照時間24 h/d條件下培養(yǎng)，每5 d全量更換1次培養(yǎng)液，稱重配子體質(zhì)量，計算配子體的特定生長率(SGR，%/d)：

SGR=(lnW2- lnW1)/(t2-t1)×100%。

其中：t2、t1分別為相鄰兩次測定時間(d);W2、W1分別為t2和t1時的藻體質(zhì)量(g)。

各稱取0.1 g DL18品系配子體，分別在不同電場強度下處理10 min后，經(jīng)組織搗碎機切碎成100～200 μm的藻段，移入培養(yǎng)皿中，置于20 ℃、50 μmol/(m2·s)、14 h/d條件下培養(yǎng)，每2 d全量換水1次，并觀測配子體生長發(fā)育狀態(tài)，計算成熟率、受精率和受精卵的萌發(fā)率。

1.2.3 配子體的采苗及育苗 每次取5 g DL18品系配子體，在不同電場強度下處理10 min后，加入滅菌海水定容至1500 mL，經(jīng)組織搗碎機切碎成100～200 μm的藻段，然后將其均勻地撒到盛有5 L培養(yǎng)液、鋪有采苗簾的塑料箱中培養(yǎng)。塑料箱(規(guī)格為40 cm×30 cm×14 cm)為白色食品級，加蓋自制透明的塑料蓋，苗簾(苗簾規(guī)格為38 cm×28 cm)為自制框架上纏繞直徑3 mm的維尼綸繩制成，苗繩間隔為2 mm。采苗前將塑料箱、塑料蓋和苗繩均進行消毒處理，采苗后黑暗過夜，從第2天開始在18～20 ℃、50～60 μmol/(m2·s)、14 h/d條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液每3 d全量更換1次，每5 d剪取苗繩鏡檢，觀察配子體的成熟、受精情況，幼孢子體出現(xiàn)后開始測量幼孢子體的長度，每次測量100個個體并取其平均值。

以上室內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)液均為大連市黑石礁海域自然海水經(jīng)沉淀過濾后，每5 L海水中添加500 mg NaNO3、100 mg KH2PO4和5 mL PI[12]溶液，加熱90 ℃以上冷卻后供試驗使用。

1.2.4 海區(qū)暫養(yǎng)及栽培 配子體采苗后經(jīng)30 d的室內(nèi)培養(yǎng)，F(xiàn)1代幼苗長度達到400 μm以上時，將苗繩移至旅順柏嵐子養(yǎng)殖場進行海區(qū)暫養(yǎng)，待幼苗長至1 cm以上時進行分苗栽培，每個處理組各夾4根苗繩，置于同一區(qū)域的浮筏上養(yǎng)殖，每月測定一次孢子體的長度和質(zhì)量，每次測量50株藻體并取其平均值。

1.2.5 F1代和F2代配子體的獲得 取各試驗組的成熟F1代孢子體，進行游孢子采集，獲得F1代配子體，進行雌、雄分離后，獲得F1代雌、雄配子體。將獲得的DL18品系 F1代配子體進行配子體采苗、育苗和海區(qū)栽培后，在試驗的第3年獲得DL18 品系F2代配子體。

1.2.6rbcL-sp-S基因序列分析

(1)組別及編號。將處理組獲得的F1代配子體及對照組F1、F2代配子體和部分組的雌、雄配子體，進行rbcL、rbcL-rbcS間隔區(qū)和部分rbcS基因序列分析 (rbcL-sp-S)，各組及其編號見表1。

表1 rbcL-sp-S基因序列分析的組別及其編號

(2) 基因組DNA的提取及檢測。使用新鮮的配子體，按照Plant Genomic DNA kit植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(北京天根生化科技有限公司)的操作步驟，提取基因組DNA。DNA純度和濃度的檢測使用NV3000超微量核酸蛋白測定儀(VASTECH美國威斯特)，當(dāng)提取DNA的OD260 nm/ OD280 nm值為(1.7～1.9)、濃度為(14.9～99.6)ng/μL時，直接用于PCR擴增。

(3) 引物的合成。本試驗中設(shè)計的引物(表2)，由上海生工生物工程股份有限公司代為合成，新合成時為干粉狀，常溫運輸即可。

表2 引物代號及基因序列Tab.2 Primer codes and gene sequences

(4) PCR反應(yīng)體系及程序。PCR反應(yīng)體系(共25 μL)：模板為1 μL， 上、下游引物各2.5 μL，Premix TaqTM12.5 μL，用ddH2O補足至25 μL。PCR擴增程序為：95 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性45 s，復(fù)性溫度退火45 s，72 ℃下延伸60 s，共進行40個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR擴增在PCR儀(Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR擴增儀)上完成。

(5) PCR產(chǎn)物回收及序列測定與分析。PCR擴增后對其反應(yīng)產(chǎn)物進行純化，使用膠回收試劑盒(上海生工)進行PCR純化反應(yīng)，然后將PCR純化產(chǎn)物送到上海生工生物工程股份有限公司進行測序。測序所得序列用MAGE 7.0軟件進行堿基差異度分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS Statistics 22.0軟件進行獨立樣本t檢驗及單因素方差分析，統(tǒng)計值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 電場強度和處理時間對DL18品系配子體存活率的影響

培養(yǎng)3 d后，不同電場強度和處理時間下配子體的存活率如表3所示。從表3可見：隨著電場強度及處理時間的增加，配子體的存活率逐漸降低，處理組與對照組間有顯著性差異(P<0.05)；在3.3 kV/cm、2 min條件下，配子存活率最高，達到99.4%±0.6%，在6.0 kV/cm、10 min條件下，存活率最低，為95.0%±1.0%；但在3.3～6.0 kV/cm、2～10 min處理范圍內(nèi)，配子體的存活率均在95%以上，說明在高壓靜電場處理下，裙帶菜配子體存活能力較強。

表3 不同電場強度和時間處理下配子體的存活率

注：*表示與對照組有顯著性差異(P<0.05)，下同

Notes: * means significant difference compared with the control(P<0.05), et sequentia

2.2 高壓靜電場對DL18品系配子體的特定生長率、成熟率、受精率和萌發(fā)率的影響

在處理時間為10 min時，不同電場強度下DL18品系配子體的特定生長率如表4所示，培養(yǎng)10 d后，雌、雄配子體的成熟率,以及成熟卵的受精率和受精卵的萌發(fā)率如表5所示。

從表4可見：處理組配子體的特定生長率與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，處理組配子體的生長均快于對照組，在電場強度為5.3 kV/cm時，配子體生長最快，培養(yǎng)30 d后，配子體特定生長率可達到9.1%±0.1%。

表4 不同電場強度處理下配子體的特定生長率

從表5可見：處理組雌、雄配子體的成熟率，以及成熟卵的受精率和受精卵的萌發(fā)率，均與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)；各組雌、雄配子體的成熟率分別達到96%、92%以上，成熟卵的受精率均達到97%以上，受精卵的萌發(fā)率均達到98%以上。

表5 不同電場強度處理下配子體的成熟率、受精率、萌發(fā)率

2.3 高壓靜電場處理后DL18品系F1代幼孢子體的生長情況

配子體采苗后7 d，雌、雄配子體逐漸發(fā)育成熟，卵受精后發(fā)育為幼孢子體，不同電場強度處理對幼孢子體生長的影響如表6所示。從表6可見：處理組幼孢子體的長度與對照組有顯著性差異(P<0.05)，處理組幼孢子體的長度均大于對照組；隨著電場強度的增加，幼孢子體長度呈先升高后下降趨勢，在5.3 kV/cm電場強度下，藻體生長最快，培養(yǎng)30 d后，幼孢子體長度為(446.8±4.4)μm，而對照組幼孢子體長度為(380.6±5.0)μm。

2.4 海區(qū)栽培結(jié)果

幼孢子體出海暫養(yǎng)20 d后，各組的藻體長度均達到1 cm以上，達到分苗標(biāo)準(zhǔn)。分苗后浮筏栽培期孢子體的長度和質(zhì)量生長情況如表7所示。從表7可見：處理組藻體在長度和質(zhì)量生長方面與對照組有顯著性差異(P<0.05)，隨著藻體的增大其生長優(yōu)勢更加明顯；2016年4月份，各組藻體長度和質(zhì)量達到最大值，處理組藻體的平均長度和質(zhì)量分別為(2.4～2.8)m、(1.6～2.0)kg，其中，在5.3 kV/cm電場強度處理下的藻體平均長度和質(zhì)量最大，分別為(2.8±0.5)m、(2.0±0.3)kg，對照組則分別為(2.2±0.3)m、(1.2±0.2)kg;5月份后，孢子體逐漸進入繁殖期，葉片梢部開始潰爛，藻體的長度和質(zhì)量逐漸降低，在5月15日測定時，處理組藻體的平均長度和質(zhì)量分別為(2.3～2.6)m、(1.5～1.8)kg，對照組則分別降低至(2.1±0.2)m、(1.1±0.3)kg。以上結(jié)果表明，高壓靜電場激勵裙帶菜DL18品系配子體后能明顯提高其F1代孢子體的產(chǎn)量。

表6 不同電場強度處理下F1代幼孢子體的長度Tab.6 Length of F1 generation juvenile sporophytes in different electric field intensities of HVEF μm

表7 栽培期間各電場強度組裙帶菜長度和質(zhì)量生長情況Fig.7 Length and weight growth of sea mustard Undaria pinnatifida in each group during the period of sea cultivation

2.5 rbcL-sp-S序列分析

由13個樣品提取的總DNA見圖3-A，rbcL基因的PCR擴增產(chǎn)物見圖3-B～D，部分rbcS基因的PCR擴增產(chǎn)物見圖3-E。每個樣品均獲得了超過2100 bp的目的產(chǎn)物，包括rbcL全序列、rbcL-rbcS 中間序列(spacer)和部分rbcS序列。

13個樣品中堿基含量見表8，其中，T、C、A、G、A+T平均含量分別為31.34%、20.28%、32.88%、15.49%、64.22%，A+T的含量均高于G+C的含量。通過核苷酸序列的對位分析(圖4)，共有約130個位點的堿基發(fā)生了缺失、置換或插入。對照組F1與F2代配子體僅發(fā)生1處堿基置換，說明自發(fā)突變較小，而處理組堿基置換明顯增多，如A→C，T→A，C→A，T→C，T→G，CT→TG，GA→CG，TCTA→CTAC等，說明高壓靜電場組的主要突變類型為堿基置換。

表8 13個樣品基因序列基本信息Tab.8 Basic information of 13 sample gene sequences

注：M為DNA Marker；A為提取的總DNA；B～D分別為rbcL基因的PCR擴增產(chǎn)物；E為部分rbcS基因的PCR擴增產(chǎn)物；1～13樣品編號分別為0 F1、0 F2、3.3 F1、4.0 F1、4.7 F1、5.3 F1、6.0 F1、3.3 F1F、3.3 F1M、4.0 F1F、4.0 F1M、0 F1F、0 F1MNote:M，DNA Marker；A，Total DNA of gametophytes；B-D，The PCR amplification by rbcL primer; E，The PCR amplification by partial rbcS primer；1-13，Sample codes of 0 F1,0 F2,3.3 F1,4.0 F1,4.7 F1,5.3 F1,6.0 F1,3.3 F1F,3.3 F1M,4.0 F1F,4.0 F1M,0 F1F and 0 F1M,respectively圖3 裙帶菜F1 、F2代配子體的總DNA及PCR擴增產(chǎn)物Fig.3 Total DNA and PCR amplified products of F1 and F2 generation gametophytes of sea mustard Undaria pinnatifida

處理組與對照組的遺傳距離矩陣如表9所示。從表9可見：對照組F1配子體和對照組 F2配子體的遺傳距離為0.002 4，對照組 F1配子體與處理組F1配子體間的遺傳距離為0～0.005 7，對照組 F2配子體與處理組F1配子體間的遺傳距離為0～0.004 2。對照組F1和3.3 F1的遺傳距離為0.002 4，此后隨著電場強度的增加，對照組F1與處理組F1的遺傳距離逐漸增大，與6.0 F1的遺傳距離達到最大,為0.005 7。

雌、雄配子體的遺傳距離矩陣如表10所示。從表10可見：6個樣品的rbcL-sp-S基因遺傳距離為0～0.006 6，對照組F1雌配子體與3.3 F1、4.0 F1雌配子體的遺傳距離分別為0.006 2和0.001 4，對照組F1雄配子體與3.3 F1、4.0 F1雄配子體的遺傳距離均為0.001 9，3.3 F1雌配子體與其他組的遺傳距離均較大，為0.004 7～0.006 6。

表9 各組基于Kimura 2-Parameter距離模式的遺傳距離

表10 雌、雄配子體基于Kimura 2-Parameter距離模式的遺傳距離

利用NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)樹表明(圖5)，6.0 F1配子體首先與其他組分開，其他組分為2大分支，一個分支為5.3 F1配子體和4.7 F1的聚合，另一分支為4.0 F1配子體首先分開，0 F2配子體與3.3 F1聚合后與0 F1組成另一個分支，表明電場強度增大，基因變異加大。由圖6可見：雌、雄組中，0 F1M配子體和4.0 F1M首先聚合在一起，接著與0 F1F聚合，然后與4.0 F1F聚合，再與3.3 F1M聚合，最后與3.3 F1F聚合；電場強度為3.3 kV/cm組，F(xiàn)1代雌配子體基因變異最大。

3 討論

3.1 高壓靜電場對裙帶菜生長發(fā)育的影響

在3.3～6.0 kV/cm電場強度、2～10 min處理時間范圍內(nèi)，隨著電場強度及處理時間的增加，裙帶菜配子體的存活率逐漸降低，但均在95%以上，表明高壓靜電場處理會使裙帶菜配子體的存活率降低，但降低程度有限；高壓靜電場處理某些種子可以促進種子萌發(fā)，提高種子活力，然而也會對某些種子無明顯效應(yīng)或者抑制種子萌發(fā)[8]。本試驗中，高壓靜電場處理對裙帶菜雌、雄配子體的成熟率、成熟卵的受精率和受精卵的萌發(fā)率均無明顯影響，表明高壓靜電場對裙帶菜配子體的發(fā)育無明顯效應(yīng)。高壓靜電場在適宜范圍內(nèi)對植物的生長均有促進作用[17]，可能是因為高壓靜電場能改變細胞酶活性，誘導(dǎo)膜電位的增大，增強其新陳代謝[8]。本試驗結(jié)果也表明，高壓靜電場激勵裙帶菜配子體后，不僅促進配子體的生長，而且還促進其F1代孢子體的生長，隨著孢子體的增大，生長優(yōu)勢更加明顯。綜上，選擇適宜的電場強度和處理時間在裙帶菜育種中尤為重要，本試驗中在5.3 kV/cm電場強度、10 min處理時間條件下，裙帶菜配子體的存活率在95%以上，獲得的F1代孢子體產(chǎn)量最高。

圖4 13個樣品rbcL-sp-S核苷酸序列的對位分析Fig.4 Para analysis of the nucleotide sequence of 13 rbcL-sp-S samples

注：-表示缺失的核苷酸 Note:-shows deleted nucleotides續(xù)圖4 13個樣品rbcL-sp-S核苷酸序列的對位分析Cont.Fig.4 Para analysis of the nucleotide sequence of 13 rbcL-sp-S samples

圖5 各組NJ系統(tǒng)樹Fig.5 NJ tree of each group

圖6 雌、雄配子體NJ系統(tǒng)樹Fig.6 NJ tree of female and male gametophytes

3.2 rbcL-sp-S基因序列分析

Rubisco是光合作用和光呼吸的關(guān)鍵酶，Rubisco大亞基由葉綠體基因rbcL編碼, 小亞基由核基因rbcS編碼，目前，已經(jīng)從細菌、海藻、陸地植物等多物種中測定了rbcL、rbcL-rbcS間隔區(qū)、rbcS基因的全序列或部分序列，構(gòu)成了相關(guān)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，可以從分子水平上揭示植物間的親緣關(guān)系和研究進化的本質(zhì)，rbcL等基因序列分析已被廣泛應(yīng)用于藻類分類鑒定中[18-21]。由于高壓靜電場生物學(xué)效應(yīng)還體現(xiàn)在可使基因發(fā)生突變[4-5]，影響基因的轉(zhuǎn)錄、表達發(fā)生變化[5]，導(dǎo)致遺傳變異現(xiàn)象，故本研究中選取驗證材料為從F1代孢子體獲得的F1代配子體，如果高壓靜電場處理使配子體發(fā)生了遺傳變異，那么在F1代配子體中將會檢測到，本試驗中同時檢測了對照組F1代配子體、F2代配子體的基因信息用來消除自我突變的影響，遺傳變異的檢測方法采用rbcL、rbcL-rbcS間隔區(qū)、部分rbcS基因序列分析，兼顧rbcL基因的高度保守性和rbcS基因保守性相對較低的特性，從而更好地表現(xiàn)出種內(nèi)的基因差異。

本研究結(jié)果表明，處理組的堿基置換明顯增多，如A→C，T→A，C→A，T→C，T→G，CT→TG，GA→CG，TCTA→CTAC等，也出現(xiàn)堿基缺失和插入情況，這與宋智青[5]的研究結(jié)果一致；對照組F1配子體與F2配子體的遺傳距離為0.002 4，對照組F1和3.3 F1的遺傳距離為0.002 4，表明電場強度為3.3 kV/cm時，基因變異較小，與自我突變相同，此后隨著電場強度的增加，對照組F1配子體與處理組F1配子體的遺傳距離逐漸增大，當(dāng)電場強度為6.0 kV/cm 時，對照組F1配子體與處理組F1配子體的遺傳距離達到最大，為0.005 7，表明隨著電場強度的增大，F(xiàn)1配子體的基因變異增大，但整體上仍在同種范圍內(nèi)，說明高壓靜電場處理裙帶菜配子體能引起遺傳變異，但對于這種遺傳變異與裙帶菜的產(chǎn)量提高間是否有必然聯(lián)系還需進一步地深入研究。

本研究中進行的rbcL-sp-S基因序列分析表明，高壓靜電場處理對裙帶菜雌、雄配子體的遺傳變異影響無明顯差異，可能是因為測定的基因序列不是性別決定基因或者測定的序列不完全，但電場強度為3.3 kV/cm 時的F1雌配子體與其他組的遺傳距離均較大，為0.004 7～0.006 6，出現(xiàn)這種情況的原因還有待進一步研究。