養(yǎng)殖大菱鲆感染嗜水氣單胞菌的分離、毒力分析及ERIC- PCR分型

徐陽，姚洪，喬幗，李華，葉仕根，黎睿君，李強(qiáng)

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila為革蘭氏陰性短桿菌，隸屬于弧菌科、氣單胞菌屬[1]。該菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中可導(dǎo)致魚、蝦等多種水生生物感染，是一類發(fā)病率高、危害極其嚴(yán)重的水生生物病原菌。感染該菌后可引發(fā)水生動(dòng)物的敗血癥，患病魚的臨床癥狀為胸鰭、尾鰭、腹鰭充血，體表潰爛，內(nèi)臟充血，體色發(fā)黑，出現(xiàn)腹水等[2-5]。

大菱鲆Scophthalmusmaximus(L.)隸屬于鰈形目Pleuronectiformes、鲆科Bothidae、菱鲆屬Scophthalmus[6]，是中國北方工廠化養(yǎng)殖的主要魚類，近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的不斷擴(kuò)大，以及缺乏對(duì)疾病的有效控制等，使得一些病原細(xì)菌廣為散播，導(dǎo)致魚類大量發(fā)病和死亡[7]。感染嗜水氣單胞菌的患病大菱鲆主要表現(xiàn)為攝食下降、活力減弱、體色變黑、腹部膨脹，各鰭基部、口部均有出血，病魚在水體中行動(dòng)遲緩[8]。筆者經(jīng)過一年多的時(shí)間，對(duì)遼寧省葫蘆島市養(yǎng)殖大菱鲆感染嗜水氣單胞菌的情況進(jìn)行了調(diào)查，本研究中對(duì)分離菌株毒力進(jìn)行了分析，并結(jié)合ERIC-PCR指紋圖譜，以期確定該病原菌的基因型及其與致病性的關(guān)系，為臨床病情防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病大菱鲆體長(zhǎng)為10～20 cm，取自葫蘆島興城市4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)和綏中縣5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，取樣時(shí)間為2014年1月—2015年4月，每月定期采樣，共獲得135尾病魚，其中從興城共獲得78尾病魚，從綏中共獲得57尾病魚?；疾〈罅怫抑饕Y狀為紅嘴及潰瘍，魚體腹部、鰭基部和體側(cè)部存在不同程度的充血。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 從患病大菱鲆心臟、肝臟、嘴、鰓、尾鰭處分離細(xì)菌，無菌條件下采用平板菌落劃線法接種在胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)48 h，挑選優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)一步純化、保種。

1.2.2 細(xì)菌鑒定 采用水煮法提取細(xì)菌DNA[9]，

所用引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物,引物序列如表1所示。PCR產(chǎn)物送往北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過Blast軟件進(jìn)行比對(duì)。

參照王友娟等[10]的方法，采用嗜水氣單胞菌的特異性引物和氣溶素基因(aerA毒素)引物進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)，引物序列如表1所示。反應(yīng)體系(共25 μL)：10×PCR buffer(含Mg2+) 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，正、反向引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，模板(40～80 ng)1 μL，Taq DNA Polymerase(BBI)0.125 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。雙重PCR反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，50 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，取出后置4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 所用引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in the experiment

1.2.3 嗜水氣單胞菌人工感染試驗(yàn) 選取健康的大菱鲆(體長(zhǎng)為10 cm，體質(zhì)量為30 g)，在規(guī)格為60 cm×40 cm×30 cm的水槽中暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖用水為大連市黑石礁海域沙濾海水，養(yǎng)殖期間鹽度為30，水溫為15～16 ℃，24 h不間斷充氧。試驗(yàn)前將大菱鲆隨機(jī)分為8組，每組15尾魚。取嗜水氣單胞菌分離株，活化培養(yǎng)后制成濃度為1.0×108cells/mL的菌懸液，腹腔注射，每尾注射0.2 mL[5,11-12]，對(duì)照組注射等量生理鹽水。連續(xù)觀察14 d，每天換水并記錄死亡情況。

1.2.4 ERIC-PCR分型 ERIC-PCR引物參照 Maiti等[13]的方法，引物序列如表1所示。反應(yīng)體系(共25 μL)：10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，正、反向引物(10 pmol/μL)各1 μL，模板(40～80 ng)2 μL，Taq DNA Polymerase(BBI)0.125 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件: 94 ℃下預(yù)變性7 min；94 ℃下變性30 s，52 ℃下退火1 min，65 ℃下延伸8 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后在65 ℃下再延伸16 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 大菱鲆感染氣單胞菌的癥狀及產(chǎn)地

2014年1月—2015年4月，從患病大菱鲆心臟、肝臟、嘴、鰓、尾鰭處共分離到98株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)16S rRNA基因鑒定，共有13株優(yōu)勢(shì)菌與氣單胞菌屬一致性達(dá)100%，編號(hào)為AP40301、AP40302、AP40303、AP40716、AP40719、AP40720、AP- 40721、AP40401、AP40402、AP40403、AP40501、AP40502和AP40503，感染氣單胞菌魚的癥狀及產(chǎn)地如表2所示。

表2 感染氣單胞菌魚的癥狀及產(chǎn)地

2.2 嗜水氣單胞菌的鑒定

經(jīng)嗜水氣單胞菌特異性引物和氣溶素基因雙重PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)13株優(yōu)勢(shì)菌中有7株在252 bp和685 bp處均出現(xiàn)清晰條帶(圖1)，這表明，此7株分離株(AP40301、AP40401、AP40402、AP40403、AP40501、AP40502和AP40503)為嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila，并有潛在致病性。

2.3 嗜水氣單胞菌人工感染試驗(yàn)

7株嗜水氣單胞菌人工感染試驗(yàn)組，第3天便開始出現(xiàn)死亡，第4天出現(xiàn)死亡高峰期，6天內(nèi)致死率為100%，表明這7個(gè)菌株毒力較強(qiáng)(圖2)；而對(duì)照組無死亡。人工感染試驗(yàn)組大菱鲆臨床癥狀主要以軀干部肌肉充血發(fā)紅為主，魚鰭基部有血絲；剖檢結(jié)果顯示，肝臟呈土黃色,膽囊呈紫黑色，腸道出血發(fā)紅，腸壁出現(xiàn)不同程度充血并伴隨少量淡紅色或淺黃色黏液。人工感染后的癥狀與大菱鲆自然發(fā)病癥狀相似(圖3)。

注：M為DL5000 DNA Marker ；1為陰性對(duì)照組(遲緩愛德華菌ATCC15947)；2～8分別為AP40301、AP40401、AP40402、AP40403、AP40501、AP40502和AP40503菌株Note：M，DL5000 DNA Marker；1，negative control(Edwardsiella tarda ATCC15947)；2-8，AP40301, AP40401, AP40402, AP40403,AP40501,AP40502 and AP40503 isolates，respectively圖1 嗜水氣單胞菌分離菌株特異性基因的瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1 Agarose elelectrophoresis for detecting specificity genes of Aeromonas hydrophila isolated strains

圖2 大菱鲆人工感染7株細(xì)菌的試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of artificial infection tests of turbot challenged by Aeromonas hydrophila isolates

2.4 嗜水氣單胞菌ERIC-PCR分型

7株嗜水氣單胞菌經(jīng)ERIC-PCR擴(kuò)增表明，PCR產(chǎn)物包含2～7條帶，有主帶2～4條，大小為180～1500 bp(圖4)。聚類分析顯示，7株嗜水氣單胞菌分為2種基因型，分別標(biāo)記為Ⅰ和Ⅱ型(圖5)。

注：A為紅鰭；B為內(nèi)臟出血Note：A，redfin；B，visceral hemorrhage圖3 人工感染大菱鲆的主要臨床癥狀Fig.3 Primary clinical symptoms of turbot in the artificial infection group

注：M為DL2000 DNA Marker；1～7分別為AP40301、AP40401、AP40402、AP40403、AP40501、AP40502、AP40503菌株Note：M，DL2000 DNA Marker；1-7,AP40301,AP40401,AP40402,AP40403,AP40501,AP40502 and AP40503 isolates， respectively圖4 嗜水氣單胞菌分離株ERIC-PCR指紋圖Fig.4 Fingerprint clustering analysis diagram of Aeromonas hydrophila isolates by ERIC-PCR

其中,Ⅰ型菌株為4株，Ⅱ型菌株3株。此外，不同地區(qū)分布的嗜水氣單胞菌的聚類特征差異明顯，Ⅰ型分離株中有3株來自綏中，1株來自興城；Ⅱ型分離株3株均來自興城。根據(jù)Hunter等[14]的計(jì)算方法,該分型方法的辨別指數(shù)值為87%。

圖5 嗜水氣單胞菌分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of Aeromonas hydrophila isolates

3 討論

嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的常見病菌，其主要感染對(duì)象包括淡水魚、蝦及其他水生動(dòng)物。本研究中，對(duì)遼寧省葫蘆島市養(yǎng)殖大菱鲆全年感染嗜水氣單胞菌的情況進(jìn)行了調(diào)查，通過細(xì)菌分離共獲得98株優(yōu)勢(shì)菌，其中，有7株屬嗜水氣單胞菌，占比約7%，說明嗜水氣單胞菌已成為遼寧地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆病害中不可忽視的一種病原菌。

3.1 養(yǎng)殖大菱鲆感染嗜水氣單胞菌的毒力分析

嗜水氣單胞菌的主要毒力因子包括外毒素、蛋白酶、S蛋白、菌毛、外膜蛋白等[1]，其中外毒素，即氣溶素(aerA毒素)，是目前公認(rèn)的主要致病因子，在細(xì)胞內(nèi)以氣溶素前體的形式合成，N末端具有一個(gè)典型的23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)序列，可引導(dǎo)無活性的氣溶素前體透過細(xì)胞膜而分泌到胞外，C末端切去25個(gè)氨基酸殘基后被激活,其作用機(jī)制是結(jié)合到真核細(xì)胞的專一受體后，該毒素即聚集成六聚體，并插入細(xì)胞的類脂雙分子層，形成3 nm的通道[15]。

研究表明，含有氣溶素的嗜水氣單胞菌均有強(qiáng)致病性。朱建萍等[16]分離自感染癥狀嚴(yán)重的三角帆蚌Hyriopsiscumingii體內(nèi)的5株嗜水氣單胞菌攜帶氣溶素基因。王友娟等[10]在對(duì)遼寧省不同地區(qū)、不同魚類、不同癥狀病魚的嗜水氣單胞菌感染情況的研究中，分離得到26株嗜水氣單胞菌，其中，有17株同時(shí)擴(kuò)增出252 bp大小的氣溶素基因。本研究結(jié)果證實(shí),所獲得的7株嗜水氣單胞菌均含有氣溶素基因，而且人工感染試驗(yàn)也證明其具有強(qiáng)致病性，這與前人的研究結(jié)果一致。本研究表明，遼寧地區(qū)患病大菱鲆分離的嗜水氣單胞菌均含有氣溶素基因，并具有高致病性，生產(chǎn)中須引起足夠重視。

3.2 養(yǎng)殖大菱鲆感染嗜水氣單胞菌的ERIC-PCR分型

由于嗜水氣單胞菌存在多種基因型，導(dǎo)致其致病性普遍存在一些差異，因此，開展氣單胞菌基因分型的研究勢(shì)在必行[17]。傳統(tǒng)細(xì)菌分型方法主要基于表型特征，但細(xì)菌表型特征受外界環(huán)境波動(dòng)影響較大，致使分型結(jié)果不是非?？尚臶18]。目前，細(xì)菌基因分型方法較多，其中，脈沖場(chǎng)凝膠電泳法(PFGE) 精確度最高[19]，但可操作性差，而ERIC-PCR法因操作簡(jiǎn)單且區(qū)分能力和重復(fù)性與PFGE法相近，更易于被普通實(shí)驗(yàn)室接受[20]。

本研究中ERIC-PCR結(jié)果顯示，葫蘆島地區(qū)7株嗜水氣單胞菌能擴(kuò)增出2～7條帶，條帶大小為180～1500 bp，可分為2個(gè)基因型，同時(shí)，7株嗜水氣單胞菌分別在約200 bp和600 bp處出現(xiàn)相同條帶。而羅志飛等[21]對(duì)南方多省的嗜水氣單胞菌進(jìn)行分型時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株條帶大小為500～3000 bp，與本研究結(jié)果有差異，說明不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖水域同種細(xì)菌的ERIC-PCR結(jié)果存在一定差異。此外，Aguilera-Arreola等[22]通過ERIC-PCR證實(shí), 宿主和環(huán)境相似的嗜水氣單胞菌菌株有聚類趨勢(shì)。然而，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，背景來源相似的嗜水氣單胞菌卻呈現(xiàn)兩種基因型，這與其他研究結(jié)果有差異。通過與肖丹等[23]報(bào)道的嗜水氣單胞菌ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型嗜水氣單胞菌是常見嗜水氣單胞菌基因型，無明顯的地域差異性，而Ⅰ型嗜水氣單胞菌可能為遼寧葫蘆島地區(qū)獨(dú)立的基因型。推測(cè)可能的原因是綏中、興城兩地的地理環(huán)境和水域環(huán)境存在著一定的差異。因此，在防控嗜水氣單胞菌引起的流行性疾病時(shí)，有必要對(duì)地方性某些獨(dú)立基因型按照其不同的流行規(guī)律制定相應(yīng)的治病方案。