2012-2015年貴州省炭疽芽胞桿菌分離鑒定及MLVA分型分析

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由炭疽芽胞桿菌(以下簡稱炭疽桿菌)引起的炭疽病幾乎遍及世界各地，四季均可發(fā)生[1]。貴州省自1957年有炭疽疫情記載以來至七十年代，炭疽病例持續(xù)增加，范圍不斷擴大，經(jīng)常有局部流行[2]。近年來貴州省人間炭疽病時有發(fā)生[3-4]，病例雖然有所減少，但發(fā)病率仍遠(yuǎn)高于全國平均水平，例如2006年發(fā)病數(shù)高達(dá)117例。與此同時，貴州省畜間炭疽疫情也較為嚴(yán)重，給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[5]。

炭疽桿菌形成芽胞以后可長期保存于土壤、草木和骨骼之中?？赡苡捎谶@一特性減少其進化頻率，使炭疽桿菌菌株具有很高的同源性。許多研究都證明，炭疽桿菌缺少分子的多樣性，例如質(zhì)粒電泳沒有差異，基因組擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、核糖體RNA (rRNA)基因限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和保護性抗原(PA)的DNA序列差異都非常小[6]。常用的脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型技術(shù)，隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)技術(shù)僅能區(qū)分炭疽芽胞桿菌同蠟樣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌，即僅能鑒定到種間差異[7-8]，而多位點序列分型技術(shù)(MLST)對芽胞桿菌的研究證明炭疽桿菌具有單態(tài)性[7,9]。1996年首次發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌中存在串聯(lián)重復(fù)序列，隨后各國研究者對炭疽桿菌染色體和質(zhì)粒DNA上的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列位點(VNTR)進行了研究，建立了能有效顯示菌株多樣性的多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)技術(shù)，并已應(yīng)用于炭疽疫情和炭疽恐怖事件中傳染源的追蹤[10]。本研究對2012-2015年貴州省疫情和監(jiān)測點來源標(biāo)本進行炭疽桿菌分離鑒定，采用世界公認(rèn)的MLVA-15技術(shù)對分離菌株進行基因分型研究，闡明貴州省炭疽桿菌的MLVA型別分布、分子多樣性和分子流行病學(xué)特征，為疫情的預(yù)警、突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置、疫情的溯源等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 血瓊脂平板和普通營養(yǎng)瓊脂平板購自鄭州貝瑞特公司，革蘭染液購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，診斷用炭疽噬菌體購自蘭州生物制品研究所，青霉素紙片購自英國OXOID公司，Taqmix 購自北京天一輝遠(yuǎn)公司，MLVA-15各位點引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成。

1.2標(biāo)本來源 收集2012-2015年貴州省炭疽疫情發(fā)生地疑似炭疽感染的標(biāo)本和監(jiān)測點采集標(biāo)本共409份，其中外環(huán)境標(biāo)本388份(土壤341份、水47份)、患者標(biāo)本19份(皮膚病灶滲出液17份、甲垢2份)和牲畜標(biāo)本2份(馬肉、豬肉各1份)。

1.3細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定 按照《炭疽診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS283-2008)進行炭疽細(xì)菌學(xué)檢查，挑取標(biāo)本接種在血瓊脂培養(yǎng)基上生長的疑似菌落進行革蘭染色鏡檢、青霉素敏感實驗和噬菌體裂解實驗，同時用陽性菌株作陽性對照。

1.4MLVA分型 將分離獲得的炭疽桿菌菌株用煮沸法(挑取單菌落于0.2 mL水中制成菌懸液，100 ℃加熱 10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后備用)提取核酸后，采用參考文獻[11]報道的引物序列和PCR方法擴增炭疽桿菌15個VNTR位點(vrrA、vrrB1、vrrB2、vrrC1、vrrC2、CG3、pXO1-aat、pXO2-at、VNTR12、VNTR 16、VNTR 17、VNTR 19、VNTR 23、VNTR 32、VNTR 35)[11]。PCR 擴增反應(yīng)體系(25 μL)含 Taqmix 12.5 μL，上下游引物(10 pmol /μL)各1 μL，DNA 模板1 μL，去離子水9.5 μL。擴增參數(shù)為95 ℃預(yù) 變 性 5 min ；95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s ，72 ℃ 1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。其中vrrB1、vrrB2位點退火溫度為55 ℃，VNTR12、VNTR16、VNTR 17、VNTR 35位點退火溫度為52 ℃，其余反應(yīng)條件均相同。

1.5MLVA聚類分析 擴增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將得到單一條帶的PCR擴增產(chǎn)物委托北京天一輝遠(yuǎn)生物公司進行毛細(xì)管電泳分析獲得菌株各位點的擴增長度，根據(jù)菌株各VNTR位點的序列長度、重復(fù)單元長度和兩翼大小推算出各位點的重復(fù)數(shù)，再運用NTsys 2.10e軟件非加權(quán)組平均法(UPGMA)根據(jù)各位點的重復(fù)數(shù)對菌株進行聚類分析，了解菌株的MLVA型別分布、分子多樣性和分子流行病學(xué)特征。

2 結(jié) 果

2.1炭疽芽胞桿菌分離鑒定結(jié)果 經(jīng)培養(yǎng)鑒定，409份標(biāo)本共分離出34株炭疽芽胞桿菌可疑菌株，菌株菌落形態(tài)特征呈扁平粗糙、不透明灰白色、無光澤、邊緣不整齊、血平板上不溶血，在低倍鏡下菌落呈卷發(fā)狀，經(jīng)革蘭氏染色后鏡下呈竹節(jié)樣革蘭氏陽性桿菌，青霉素抑制試驗和噬菌體裂解試驗均為陽性。各類標(biāo)本中，388份外環(huán)境標(biāo)本檢出33株炭疽桿菌，檢出率為8.51%；19份患者標(biāo)本中檢出1株炭疽桿菌，檢出率為5.26%；2份牲畜標(biāo)本中未檢出炭疽桿菌；各類樣本檢出結(jié)果見(表1)。

表1 2012-2015年貴州省各類標(biāo)本炭疽桿菌檢出情況表
Tab.1 Detection results of B. anthracis strains from different type of samples in Guizhou from 2012 to 2015

2.2炭疽芽胞桿菌15個VNTR位點重復(fù)數(shù)目分析結(jié)果 經(jīng)VNTR位點PCR擴增和凝膠電泳檢測，對經(jīng)凝膠電泳檢測產(chǎn)生清晰條帶的34株菌株各VNTR位點產(chǎn)物進行毛細(xì)管電泳分析，結(jié)合序列長度、重復(fù)單元長度和兩翼大小推算出各位點的重復(fù)數(shù)(表2)。

2.3炭疽芽胞桿菌MLVA-15聚類分析 按照15個VNTR位點重復(fù)數(shù)完全相同定義為一個MLVA基因型劃分，可將34株菌分為3個MLVA型(圖1)。聚類分析顯示(圖1)，34株菌株被分為A和B兩簇，其中A簇又可進一步分為A1和A2分支， 2014年分離自織金縣土壤的2014008菌株單獨形成A2型。34株菌中有22株菌屬A1型，占64.71%。另外11株屬B型，占全部型別的32.35%。來自甕安、望謨的多數(shù)菌株聚類關(guān)系分別較近，MLVA型別分布具有明顯地域性。

3 討 論

近年來，貴州省每年均有炭疽病例報告，病例雖然有所減少，但發(fā)病率仍遠(yuǎn)高于全國平均水平。本研究對來自2012-2015年貴州省炭疽疫區(qū)的土壤、水樣、人畜污物等409份標(biāo)本進行炭疽芽胞桿菌分離鑒定。結(jié)果顯示，共分離出34株炭疽桿菌菌株，檢出陽性率高達(dá)8.31%，低于2006-2011年從830份標(biāo)本中分離出88株炭疽桿菌的檢出率10.60%[12]。此外，19份皮膚炭疽患者標(biāo)本中僅1份標(biāo)本檢出炭疽桿菌，檢出率為5.26%，其分離率低的原因可能與患者接受抗生素治療或采樣時間有關(guān)，因此，為能準(zhǔn)確獲得病原學(xué)依據(jù)，應(yīng)盡可能在使用抗生素等藥物治療前采樣進行病原學(xué)檢測。本次檢測的341份土壤標(biāo)本分離33株炭疽桿菌，所分離菌株數(shù)占總菌株數(shù)的97.06%，提示疫源地外環(huán)境污染的嚴(yán)重性和暴發(fā)疫情的潛在危險，當(dāng)?shù)匦l(wèi)生與動物防疫部門應(yīng)加強監(jiān)測，并對環(huán)境進行消毒處理。此外，其余47份水樣、2份病畜肉均未分離出炭疽桿菌，可能因未采集到被炭疽芽胞或菌體污染的水樣或未能準(zhǔn)確采集到病畜帶菌部位所致。

2012-2015年檢測出的34株炭疽桿菌來源于黔西南州、黔南州、畢節(jié)3個地區(qū)，其中以黔西南州居首位，其次為黔南州和畢節(jié)地區(qū)，檢出菌株數(shù)分別為25、8和1株。黔西南州的望謨縣檢出25株，為檢出菌株數(shù)最高的縣，占73.53%。甕安、織金縣分別檢出8株、1株炭疽桿菌，其中有2株菌株為采集消毒處理一年后的歷史疫源地所分離，提示消毒處理不徹底，仍然存在發(fā)生炭疽疫情的風(fēng)險。

MLVA技術(shù)因其能有效反映炭疽桿菌多態(tài)性的特點而被應(yīng)用于炭疽桿菌的分型和疫情的分子流行病學(xué)調(diào)查研究[13]。本研究基于15個VNTR位點的MLVA-15技術(shù)將2012-2015年貴州省分離的34株炭疽桿菌進行基因分型結(jié)果顯示34株菌株被分為3個MLVA型別，反映了貴州省近年炭疽桿菌流行菌株的分子多樣性。此外，聚類分析顯示(圖1)菌株2013001～2013007、2014007和2015001～2015003為同一MLVA型，被聚類為同一分支(B)，2014001～2014006、2015004～2015019為同一MLVA型，被聚類在同一分支(A1)，而分離自織金的2014008菌株獨立為基因型A2分支。本研究中來自望謨縣土壤樣本共分離炭疽桿菌25株，除3株菌株2015001～2015003分離自油邁鄉(xiāng)為基因型B外，其余菌株均屬基因型A1。從地域或時間分布來看，34株菌株中多數(shù)來源于相同區(qū)(縣)或年份的菌株之間聚類關(guān)系相對較近，菌株聚類關(guān)系具有明顯地域和時間分布特點，提示不同地區(qū)的疫情由不同基因型別的菌株所致。

本研究中菌株2013001～2013007來源于2013年甕安縣同一起疫情標(biāo)本分離所得，7株菌株均被劃分為同一基因型B。值得注意的是，該起疫情解剖地土壤經(jīng)消毒后2014年再次采取樣本依然能分離出一株炭疽桿菌(菌株號2014007)，與菌株2013001～2013007聚類最接近，同為基因型B，提示疫情發(fā)生地仍然是炭疽桿菌的疫源地，應(yīng)引起當(dāng)?shù)匾卟》揽叵嚓P(guān)部門重視。

炭疽歷來是嚴(yán)重危害貴州省人獸健康的主要急性傳染病之一，貴州省已被衛(wèi)生部確定為重點炭疽監(jiān)測省份。由于炭疽芽胞桿菌遺傳信息的保守性，一般的分子分型方法難以將菌株的遺傳特征進行有效鑒別，本研究我們采用15個VNTR位點的MLVA分型方法對貴州省近年炭疽桿菌進行基因分型，初步了解了貴州省2012-2015年間炭疽桿菌基因型別特征及其多樣性，結(jié)果將為貴州省炭疽疫情發(fā)生時對傳染源進行溯源、了解傳播途徑以及對炭疽防控措施的制定提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。同時，本研究中所采用的MLVA-15技術(shù)也是貴州省首次引入該技術(shù)對炭疽桿菌進行病原學(xué)分析，為貴州省炭疽疫情防控提供了技術(shù)儲備。